小鼠肿瘤样本单细胞悬液的制备及注意事项

小鼠肿瘤样本制备

1. 颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，75% 酒精浸泡 5 min，取出小鼠置于无菌操作台上。
2. 左手持镊子，右手持弯剪，沿肿瘤边缘剪下长约 1cm 的口子，可清晰看见肿瘤附着于皮下，沿肿瘤边缘轻轻剪开连接处，剥离肿瘤。
3. 将剥离的肿瘤放入100 mm 的培养皿中，并在室温下加入 5~10 mL 的 1640 基础培养基。

单细胞悬液的制备

A.混合酶消化法

1. 待所有肿瘤剥离完毕后，将肿瘤转移至 1.5 mL EP 管中，手持弯剪将肿瘤充分剪碎，边剪边加入1640基础培养基，静置数秒，使用 1 mL 移液器吸出上层较小颗粒，继续剪碎组织，重复加入1640基础培养基，直至所有的组织大小均符合要求。
2. 将肿瘤组织悬液转移至 50 mL 离心管中，加入 1640 基础培养基，250 g离心5 min，弃上清，加入4.5 mL 的 1640 基础培养基，重悬细胞沉淀并转移至培养皿中。
3. 加入 500 μL 的 10×Triple Enzyme stock solution 混合酶溶液，轻轻吹打至充分混匀，转移至37℃水浴摇床消化孵育 1~2 h。
4. 消化结束后用 1640 基础培养基或者 PBS 稀释，再用 200 目筛网，除去残留的组织块，并使用5~10倍体积的 1640 基础培养基或者 PBS 缓冲液洗涤一次，过滤至无组织块为止，获得单细胞悬液。
5. 收集细胞悬液，300 g离心5 min，弃上清。
6. 用细胞染色缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度至 1×10⁷/mL。

1. 研磨法
2. 提前准备好 200 目的一次性细胞筛网，用 1640 基础培养基或者 PBS 润湿并浸泡备用（浸泡放置于 6 cm 细胞培养皿或者 6 孔板）。
3. 将剥离的肿瘤组织转移到 200 目的细胞筛网，用无菌眼科剪剪成小颗粒。
4. 取 2.5 mL注射器活塞，用软头打圈方式研磨组织，研磨至筛网上无明显的组织块为止，取新鲜的 1640培养基或者 PBS 冲洗筛网 2~3 次。
5. 将获得的细胞悬液用 200 目细胞筛网过滤。
6. 收集细胞悬液，300 g离心5 min，弃上清。
7. 用细胞染色缓冲液重悬细胞，并调整细胞浓度至 1×10⁷/mL。

8. 注意事项：

   1. 肿瘤体积一般不超过 1000 mm³，肿瘤质量在 0.6~0.8 g 之间。（若肿瘤较大下述各反应体系加倍）。
   2. 酶消化法剪刀剪碎肿瘤的标准为，其可被1 mL 的枪头自由吸取，无阻碍。
   3. 酶消化法时要避免组织消化过度，需要每隔 20 min取出观察，无明显组织块后即结束消化；细胞团块越小，消化越快，1 mL 移液器可以吹打的组织块，约消化 30~60 min 即可完成；若组织难以剪切，也可以切成大小 1~2 mm³ 左右大小，每 30 min 用 1 mL 的移液器吹打混匀一次，直至可以顺畅通过，约 1~2 小时可以充分消化。
   4. 研磨时为尽量减少细胞损伤，需要浸泡于培养基中研磨，避免干磨。