小鼠脾脏单细胞悬液制备流程及注意事项

小鼠脾脏单细胞悬液制备流程

1. a)研磨法
2. 小鼠颈椎脱臼处死，置于75%酒精浸泡5 min后，取出小鼠，置于无菌操作台上，左腹侧朝上。
3. 小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。
4. 脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露出脾脏。用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，并浸泡于干净的PBS溶液中。
5. 将脾脏置于200目筛网中，用组织研磨棒轻轻研磨至没有明显红色块状物。
6. 用15 mL PBS冲洗筛网，并将冲洗液收集于15 mL离心管，300 g离心5 min，弃上清。
7. 加入2 mL 1×红细胞裂解液重悬细胞，室温裂解2~3 min后，立马加入10 mL PBS，300 g离心5 min，弃上清。
8. 用细胞染色缓冲液重悬脾脏细胞，将细胞悬液用200目筛网再次过滤后计数, 并调整细胞浓度至1×10⁷/mL。

1. b) 吹打法
2. 小鼠颈椎脱臼处死，置于75%乙醇浸泡5 min后，取出小鼠，置于无菌操作台上，左腹侧朝上。
3. 小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。
4. 脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露出脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏并浸泡于干净的PBS溶液中。
5. 取无菌的2.5 mL的注射器吸取PBS，左手用镊子夹持脾脏，右手持注射器，小心插入脾脏中吹打，至脾脏细胞完全被吹打干净，观察只剩余白色的结缔组织和脂肪组织为止，镊子夹取剩余的白色组织在PBS中轻轻润洗。
6. 将吹打出的细胞用200目筛网过滤，收集于15 mL离心管，300 g离心5 min，弃上清。
7. 加2 mL 1×红细胞裂解液重悬细胞，室温裂解2~3 min，立马加入10 mL PBS，300 g离心5 min，弃上清。
8. 用细胞染色缓冲液重悬脾脏细胞，计数，并调整细胞浓度至1×10⁷/mL。

   注意事项：

   1. 一个正常大小的脾脏，根据经验大约可以得到4×10⁷个细胞，实际细胞数以计数结果为准。
   2. 淋巴细胞约占小鼠脾脏裂解红细胞后总细胞量的60%~70%。
   3. 未染色的脾脏细胞样本，可以在荧光通道中看到少量（大约百分之零点几）非特异性信号。
   4. 若没有组织研磨棒，也可以用注射器里面的推杆替代。用推杆前端的橡皮垫研磨脾脏。
   5. 收集的脾脏细胞如需进一步培养，取小鼠脾脏时需置于无菌操作台上。如果只是做普通的流式实验，则可以不考虑无菌环境。
   6. PBS可以用细胞染色染冲液替代。
   7. 裂解红细胞这一步，裂解时间具体以实验过程中裂红的效果来判断。