小鼠腹水及单细胞悬液制备及注意事项

小鼠腹水及单细胞悬液制备流程

1. 配制 6% 淀粉肉汤。

6% 淀粉肉汤配制方法：牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1.0g、氯化钠 0.5g、蒸馏水 100mL，上述材料混合加热后加入可溶性淀粉 6.0g；溶解后，121℃ 高压灭菌 15~20 min，EP 管分装封口，将肉汤放置于 4℃ 保存。

1. 小鼠腹腔注射 1mL 6% 淀粉肉汤（注意避开肠管和内脏），刺激 60~72h。
2. 颈椎脱臼法处死小鼠，用 75% 酒精浸泡小鼠 5min。
3. 将小鼠置于解剖板中，固定四肢，剪开皮肤，充分暴露腹膜。
4. 用眼科镊子提起腹膜，用 5mL 注射器往小鼠腹腔注射 2.5mL 预冷 PBS（勿扎到脏器），轻揉小鼠腹部1~2 min。注射器回抽腹腔灌洗液，收集于15mL 离心管中。
5. 重复第 5 步 5 次，冲洗腹腔，可观察到冲洗液逐渐澄清。
6. 将收集的腹腔灌洗液 300 g 离心 5 min，弃上清。
7. 用细胞染色缓冲液或者含 10% 胎牛血清的 1640 培养液重悬细胞。
8. 进行细胞计数，并调整细胞浓度至 1×10⁷/mL。
9. 

   注意事项：

   1. 若第 7 步离心弃上清后发现细胞沉淀中有较多红细胞，且检测目的细胞非红细胞，先加入适量红细胞裂解液裂解红细胞（可加入 500 μL 1× 红细胞裂解液重悬细胞，室温裂解 2 min 后，立马加入 10 mL PBS，300 g 离心 5 min 后弃上清）。
   2. 若提取的腹腔巨噬细胞需培养，请注意无菌操作。
   3. 收集腹水时，从小鼠左侧（肠道较多）注射 PBS，从右侧（器脏较大）抽腹腔灌洗液，注意不要扎到器脏。
   4. 小鼠腹腔灌洗液收集细胞比较脆弱，加细胞染色缓冲液有利于细胞的保存，但建议当天及时检测。
   5. 小鼠腹腔灌洗液中大多数为巨噬细胞，巨噬细胞检测需要封闭Fc受体，此时可使用小鼠 CD16/32纯抗[E-AB-F0997A]进行封闭：往 100 μL（细胞数1×10⁶）细胞悬液中加入 1 μg 纯抗，室温封闭 15 min，直接加入流式抗体进行后续实验。
   6. 巨噬细胞检测应尽量避免使用含花青素的流式抗体（如 PE-Cy7），会增加非特异性染色。若为非巨噬细胞检测，使用含花青素的流式抗体（如 PE-Cy7）时也需要封闭。