专业科普：高质量细胞上清液外泌体如何提取

首先，从细胞的培养过程下手。外泌体来自细胞，因此必须先从源头抓起。大部分的细胞培养过程中都是带有血清的，无论是牛血清、马血清等都是含有异源外泌体的，而我们研究的目标通常是细胞所分泌的外泌体，因此需要尽可能的去除这些异源外泌体的干扰。那么我们需要怎么做呢？

这里需要了解一个大原则：在细胞正常生长的条件下，尽可能的减少血清外泌体或者不使用血清。方法一，可以通过超速离心的方法去除血清中外泌体。方法二，通过外泌体专用无血清培养基来替代完全培养基，维持细胞一段时间的生长后收集细胞上清液。但是这两种方法都会存在一定的不足的，去外泌体血清难以做到 100% 的去除的，因此即使 1% 的血清外泌体残留也带来大量的异源外泌体，而外泌体专用无血清培养基，也不是适合所有的细胞，常见的肿瘤细胞培养通常都可以维持生长，而那些血清培养都困难的细胞就难以通用了，所以也需要一些预实验的摸索。

还有，那些 DMEM、1640、F12 的基础培养基是否可以替代血清或者外泌体专用无血清培养基呢？这样是不行的。因为细胞在这些基础培养基的环境下，是处于饥饿状态的，细胞会将培养基中的营养物质（包括外泌体）全部消耗掉的，这时的上清液中的外泌体含量大幅度下降。

接着，从细胞上清液的预处理下手。拿到细胞上清液收集后该如何处理呢？这是一个常见问题。我们先要弄清楚细胞上清液中会有什么物质？除了我们感兴趣的外泌体外，还有少量细胞、细胞碎片、游离蛋白、脂类等。我们首要做的就是通过差速离心尽可能的去除一些杂质物，先用 800 ~ 1000g 左右的离心力 10 分钟有效去除细胞残留，取上清后，再 8000 ~ 10000g 离心 10 分钟有效去除细胞碎片物，这时候的上清液就可以进行保存了。短期 3 ~ 4 天左右使用的话，则可以放到 4℃ 的冰箱中，而长期个把月后使用的话，则在 -80℃ 进行保存，使用前取出来 4℃ 自然融化即可。那么这些离心操作是否可以不做呢？不可以的。细胞上清液处理的越早越好，处理晚时存留细胞会坏死而破碎，更多的胞内囊泡就会释放出来了，这时候的样品就更加的复杂了，更不利于后期的研究了。

然后，针对细胞上清液的初步浓缩。之前在做技术答疑时，并没有建议做初步的浓缩操作，但是后来越来越多的同学遇到在细胞外泌体提取过程中无论采取什么样提取方法都很难看到外泌体沉淀，心中就没了谱，下游的检测项目做的更是提心吊胆。因此，在这里给出了通过超滤方法进行浓缩处理的建议。超滤的原理就是利用一定的尺寸大小的滤膜拦住大颗粒物而放过小颗粒物的原理，在离心管中最终呈现上液和下游，我们在根据实验目的各取所需。针对细胞上清液的特点，建议可以使用 10 KD ~ 100 KD 之间的超滤管来进行样品浓缩，外泌体通常是在超滤离心管的上室中，浓缩倍数控制到 5 倍左右；针对干细胞、神经细胞等可以将浓缩倍数提升到 10 倍左右，因为这些细胞外泌体分泌量相对肿瘤细胞来说要少很多。

最后，针对细胞上清液的外泌体的提取。这个是老生常谈的问题，这里就不再多讲了。如果实验室有超速离心机的话，那就使用超速离心的方法，按照前文建议的预处理操作后，超离后的沉淀也会增加的，同时外泌体的质量也会提升。如果实验室没有超离的情况下，也可以通过试剂盒的方法来提取，除了进口品牌外，也可以使用一些国产试剂盒，质量也不亚于进口品牌的。

总结一下，为了获得高质量的外泌体：需要在细胞培养时减少正常血清的使用，推荐去外泌体血清或者外泌体专用无血清培养基；收获到了细胞上清液时，依次离心去除细胞、细胞碎片后进行存储；通过超滤方法浓缩上清液体积，提高外泌体浓度；最后通过超离或者试剂盒的方法提取外泌体。

以上的方法针对制备科研级别的外泌体质量会大有提升，如果要针对大规模（几升以上）的则需要结合其他的方法来操作。

文章图文来源：宇玫博生物