献给初学者：手把手教你做免疫共沉淀实验

转染后 24～48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 min，细胞裂解液于 4 ℃，最大转速离心 30 min 后取上清；

取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1 μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4 ℃ 缓慢摇晃孵育过夜；

取 10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3 000 rpm，离心 3 min；

将预处理过的 10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4 ℃ 缓慢摇晃孵育 2～4 h，使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连；

免疫沉淀反应后，在 4 ℃ 以 3 000 rpm 速度离心 3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1 ml 裂解缓冲液洗 3～4 次；最后加入 15 μl 的 2 × SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟；

SDS-PAGE，Western blotting 或质谱仪分析。

用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。

将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4 ℃ 以最大速度离心 15 min。

收集上清（约 30 ml）并加入 30 μg 的适当抗体，4 ℃ 摇动免疫沉淀物 1 h。

加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4 ℃ 摇动免疫沉淀物 30 min。

用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。

吸出混合物的液体部分。加入 800 μl 的 1 × SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min。

将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜。

通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1 ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min。

用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI 477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。

细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或 Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％ SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。

使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。

使用对照抗体：

① 单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗

② 兔多克隆抗体：正常兔 IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：

① 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生

② 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀

③ 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定