四步致胜奇招 高效克隆你值得拥有（下篇）

上篇我们对经典分子克隆技术和无缝组装克隆技术进行了比较，经典分子克隆兜兜转转、如琢如磨，而无缝组装克隆技术却能做到操作简单和方便快捷。那它究竟是如何实现的呢？本期我们就来具体聊聊无缝克隆的四步致胜奇招。

无缝组装克隆之 Step 123——带你飞，把还在用传统方法“琢磨”的他甩在后面

基于同源序列的无缝组装克隆技术，关键是利用 PCR 引物，在目标片段两端引入与线性化载体两端同源的一段序列。基本策略是

1. 选定插入外源片段的位置，以此线性化载体
2. 设计包含线性化载体两端序列和目标片段两端序列的引物，扩增目标片段
3. 扩增片段与线性化载体、组装预混酶混合反应
4. 转化感受态细胞

· Step 1 ·

如果载体上正好有合适插入目标片段的酶切位点，酶切载体使之线性化。为了降低单酶切载体不完全的几率，减少载体自连和提高筛选成功率，强烈建议双酶切——后面一个切点只要距离第一个切点 5 个碱基以上就行（主要是给两个酶留出结合空间）。如果没有合适的酶切位点，根据选定插入位点设计引物，用反向 PCR 来获得线性化载体。在多片段组装克隆的世界里，凡是酶切搞不定的，统统 PCR 引物设计搞定。简单粗暴有效。

· Step 2 ·

根据线性化载体两端的序列，设计目标片段的引物——划重点！这对引物外侧要有 15-40 碱基与载体两端分别同源，内侧要有 15-20 个碱基与目标片段同源。如果想要设计启动子 SD 序列跟 ATG 的距离，这就是好机会。合成引物不要超过 65 个碱基为好。

· Step 3 ·

以这对引物PCR目标基因，就能得到两端与载体同源的目标片段。按比例混合片段和线性化载体，加入关键试剂——预混酶并在 50 度保温 15-60 分钟（因插入片段数量而略有不同，以操作手册为准）——以赛默飞的 GeneArt™ Gibson Assembly® 克隆试剂盒系列为例，Gibson Assembly 实际上是生命科学狂人文特尔（就是那个敢单挑 6 国合力的国际人类基因组计划还占尽上风，逼得当时美国总统出面协调让双方合作并同时发表结果的）东山再起后成立的 Venter 研究所旗下 Gibson 博士开发的，里面包含了精心优化搭配的三种酶活性：外切酶会外切双链末端而产生单链 3’突出端，使得外源片段和线性化载体的互补末端能够退火，聚合酶活性会填补退火片段产生的缺口，连接酶活性能够在重组后进行连接。得到的产物是闭合载体，可以直接进入 Step 4 了。

· Step 4 ·

转化感受态细胞或者 RCA 了。还有的产品甚至连后面的聚合酶和连接酶都不需要，克隆效率一样高还能避免填补缺口时的意外错配，强的。

因为整个过程不会引入额外的碱基，可在预定位置精准插入外源片段，因此亦有无缝克隆，无痕克隆的美誉。这个方法还可以实现一步完成多个片段连续组装，只要设计 PCR 引物让相邻片段之间具有 15-30 个碱基的同源序列重叠，就可以实现单管一步反应，完成组装，而且还成功率高，保真度高，能大大减少重复筛选验证的工作量。

多片段连续组装如此简单易行，有越来越多应用之处——不单用于一般的多亚基/多调控元件/多蛋白表达载体构建或者融合基因，还可以用于合成超大片段基因且成本低廉；甚至基因的多位点定点突变甚至改造 DNA 也能大显身手——只要在目标基因内分区并在设计 PCR 引物时引入突变位点或者改造序列就可以实现。

当然，不同的需求和应用：2-3 个片段组装和 15 个片段组装、1-2 kb 和 100 kb 片段组装，实际操作起来优化条件肯定不完全一样，甚至超长片段适用的转化菌株也跟普通菌株不一样（比如 GeneArt EX 超长版就建议用 DH10B 电转感受态细胞）。市面上有多种为满足不同需求而优化条件的商品化组装克隆试剂盒，可以根据自己的需求选出最合适自己需要的——选对合适的 Kit ，每天都是好心情，实验高歌猛进充满成就感；选不合适就只能天天 re-search 了——反反复复来来回回(re-)地摸索(search)尝试，挺折磨的。选择kit时一般留意几个参数：插入片段长度，单次反应可插入片段数量，同源序列长度——即合成引物时要求添加的载体同源序列长度，反应时间，当然还有克隆效率（几个领先品牌的产品说明都显示单片段插克隆效率> 95%——片段越多效率会下降的）。市售产品中，是否包含感受态细胞，是否包含质粒纯化试剂或者 PCR 纯化试剂，都会影响产品单价。

后继的筛选验证工作同经典方法一样——抗性筛选，挑克隆扩增纯化，电泳+酶切或者 PCR 验证，最后挑几个最有可能的克隆去测序验证。如今分子克隆中的 PCR 一般都会选择高保真酶——出错率比 Taq 低得多、扩增长片段效果更好，要是几十 kb 还得是 EX 加长版高保真酶——相比后继测序验证的费用，这钱万万省不得的。

总而言之，基于同源序列的无缝组装克隆技术，相比经典分子克隆技术可谓飞跃提升，更为强大，更容易操作，适用性与设计灵活性更强，是值得深入了解的入门必备基础实验技能。回顾分子克隆技术的发展，亦可以体会到开放性思维如何从已知中推进技术发展，技术进步对我们日常实验乃至对生命科学的认知会产生怎样翻天覆地的影响。

文章来源：赛默飞世尔科技