四步致胜奇招 高效克隆你值得拥有（上篇）

《分子克隆》

虽然伟大的、人手必备的“分子生物学宝典”——《分子克隆》——里涵盖了分子生物学领域几乎各种基础技术（新中文版三册足足 3.5 公斤，知识就这么沉重），但实际咱们平时说的分子克隆技术主要是指将含有“目的基因的 DNA 片段”以“体外重组技术”插入某种 DNA 载体上，得到一个重组 DNA 分子。分子克隆技术现在早已算不上是“超酷”的前沿技术，只能算分子生物学基础入门技术，但它依然是整个分子生物学基础的核心之一，熟练掌握分子克隆技术之关键、又快又准地完成分子克隆依然是实验必需的看家本领。

经典分子克隆技术vs无缝组装克隆技术

技术总是随着时间向前发展的，由难到易，化繁为简，将不能变为可能。分子克隆技术的发展完美体现了这一点。

以构建表达载体为例，经典分子克隆中，要将目标片段插入载体，全靠内切酶的拆分和连接酶的拼接。关键是选择合适的酶切位点，使得酶切“拆”得的目标片段末端和相应载体末端正好能互补“拼”在一起，连接酶才能连起来。选择酶时首先不能破坏目标基因完整性（包含从起始密码到终止密码）及载体完整性；其次，尽量避免选两个酶切生成粘端一样的（粘端互补）——两边粘端一样的载体“偏爱”自我连接、目标片段正向/反向插入傻傻分不清，徒增后面的筛选烦恼。做实验，有时真需要一点运气。

好运气不常有，合适的酶切位点跟合适的爱情一样不那么容易碰到。载体和片段的酶切位点难得一致——有时你有我无，有时前后顺序相反，有时两边全都对不上。但是“拼接”双方的任务是必须完成滴，运气不够就要靠技术和经验：有没有同裂酶？有没有能产生同样粘端可互补的酶——举例说 BamH I(G/GATCC)、Bcl I(T/GATCA)、Bgl II(A/GATCT)、Dpn II(/GATC)、BstYI(R/GATCY) 这几个酶切产物粘端突出部分都一样是 5’GATC，能互补，可以相互连接。此外，所有平末端酶切产物都可以相互拼接，只是连接效率低些。要是运气再背点、酶切粘端怎么都不配对？用 Klenow 大片段或者T4聚合酶或“削平”或“补齐”得到平末端，再“强行连接”。。。这种目标片段前后都是平端的、或者单酶切的，载体“自恋”（自我连接）还可以用大小区分，目标片段可能正向接入或者倒装，如何在筛选时进行区分，又多了一个麻烦事儿。要是用到甲基化敏感的内切酶，比如 HPhI（对 Dam、Dcm 甲基化敏感），需要用有特定甲基化背景（dam-/dcm-）菌株扩增得到的质粒才能切割，等等，（此处省略若干连载）。

酶界之“求同存异，合作共赢”

只要“切削补”得到平末端，都能凑一起

终于盘算好能让目标片段和载体牵手了，你还得要检查一下这一轮操作插入载体后，在目标基因 ATG 前面会不会意外引入终止密码、或者不同编码框的 ATG ——提前终止或者密码“三观不一致”都可能影响后续的表达。筛选时需要有可靠的方法来验证目标片段大小是否正确、“正向插入”还是“反向插入”。有时还需要考虑 ATG 距离启动子后 SD 序列的距离是否合适，如果不合适可能会影响表达效率。“酶切复酶切，电泳加连接”，讲真，这一圈下来有时挺让人崩溃的。

技术的发展不断向前。受同源重组启发而出现的重组酶和 TOPO 克隆技术，能快速实现目标基因到载体、以及不同表达载体之间切换构建，但需要分别在载体和目标基因两端各引入一段特定酶识别序列，以实现同源重组，而这额外十多个碱基的特定序列始终保留在克隆产物上消不掉——目标片段后面多一点不要紧，目标片段前面这一截（通常在启动子后/ ATG 前面）真是如鲠在喉——要是这段序列正好是载体两端的序列就好了。

无缝克隆技术应运而生

通过引物在目标片段两端添加一小段跟载体两端同源的序列，扩增得到的目标片段和线性化载体对应的末端同源，用特定外切核酸酶消化末端数个碱基得到粘末端，就能互补结合——全程不会加入额外的碱基！

几家克隆技术领先的公司先后推出了基于同源序列的无缝组装克隆技术，取代内切酶甚至连接酶，能够实现在任意载体的任意位置无缝（无痕）插入任意长度的目标片段——任意大小、任意 GC 含量、甚至内部重复序列结构，统统都能实现精确的正向无缝克隆——没有插入方向的困扰，没有找酶切位点对眼神的繁琐，基本能避免载体自连接，启动子后 SD 序列与 ATG 的距离也可以自行控制而不再是问题。简直完美。经过不断优化，如今一次过将多达 15-20 个片段按顺序排列、一次性克隆到载体上，甚至单个片段 100 kb 连续组装合成，都成为可行。那些曾经的克隆之困，比如特别大的片段克隆、构建共表达载体、同一载体表达多个亚基/蛋白或者调控元件、或者需在克隆外源基因的同时给它加上标签或者信号肽修饰或者融合基因什么的，都不再成为难题，一切变得可行了，并且操作简单，方便快捷。回望对比一下传统克隆的兜兜转转、如琢如磨，无缝组装克隆技术的进步实在令人赞叹！

它到底有多神奇，哪四步致胜奇招，篇幅有限，具体我们下回再聊！

文章来源：赛默飞世尔科技