质粒DNA的纯化

（一）聚乙二醇沉淀法质粒ＤＮＡ
这里介绍的方法（R.Tresman,个人通讯）已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒ＤＮＡ。
１）将核酸溶液[上页步骤９）所得]转入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用Ｓorvall SS34 转头（或与其相当的转头）于４℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ。
２）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
４）用500μl含无ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒ＤＮＡ沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于４℃以12 000g离心５分钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ。
８）吸去上清，加200μl处于４℃以12 000g离心２分钟。
９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10）用500μlＴＥ（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用ＴＥ（pH8.0)] 后测量ＯＤ260，计算质粒ＤＮＡ的浓度（１ＯＤ260＝50μg质粒ＤＮＡ/ml）， 然后将ＤＮＡ贮于－20℃。

（二）氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环ＤＮＡ

１．连续梯度
１）测量ＤＮＡ溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。
２）每10mlＤＮＡ溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表成）与ＤＮＡ－氯化铯溶液混匀， 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度应为大约７４０μg/ml。溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子）。于室温保存。
３）于室温用Sorvall SS34头（或与其相当的转头）以8000转/分离心５分钟， 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
４）用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到适用于Beckman Ti65重直转头或Ｔi50、Ti65或Ti70 角转头（或与它们相当的转头）
的离心管（Beckman Quick-seal或与之相当的离心管）中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。
５）于20℃对所得的密度梯度以45 000转/分离心16小时（VTi65 转头）、 以45 000转/分离心48小时（Ti50转头）、以60 000转/分离心24小时（Ti65转头）或者以60 000转/分离心24小时（Ti70.1转头）。在普通光照下，在梯中心可见两条ＤＮＡ区带， 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）ＤＮＡ和带切口的环状质粒ＤＮＡ组成：下部区带则由闭环质粒ＤＮＡ组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭ＲＮＡ复合物，位于ＣsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒ＤＮＡ而不至超负荷。如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体ＤＮＡ相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。如出现负荷，可收集整个ＤＮＡ区高水平时才会出现，只要产将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。如出现超负荷，可收集整个ＤＮＡ区带，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使ＤＮＡ达到平衡。
６）收集ＤＮＡ带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用１８号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体ＤＮＡ）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后用一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将１８号皮下注身针头（其斜面向上）斤插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体ＤＮＡ区带之下并与该区带相平行。将粘稠状ＤＮＡ收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封信皮下注射针头的未端并将第２根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第３根皮下注射针头（18号），将下部的质粒ＤＮＡ区带收集到玻璃或塑料管中。
２．不连续梯度
　　该方法是将含不同浓度CsCl的溶液分层加到离心管中，这样可以加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到６小时。
１）将125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，制成CsCl溶液（ρ＝1.47g/ml）。
２）将8ml氯化铯溶液加到Beckman Quick-Seal 离心管（或与其相当的管）中，搁置一旁等步聚８）使用。
３）如有必要，可酌情用TE(pH8.0)将质粒ＤＮＡ溶液的体积精确地调到3ml。
４）在质粒ＤＮＡ溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30℃以促进盐溶解， 小心地混匀溶液直至盐溶解。
５）称量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好达13.2g，用天平称量时应注意去除管的重量。
６）加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水），快速混匀溶液直至染料均匀地分散，此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。溴化乙锭贮存液应于室温贮存在避光容器中（如完全用锡箔包裹的瓶子）。小心：溴化乙锭是一咱强诱变剂，并在中度毒性。
接触含有该染料的溶液应戴手套。
７）于室温用Sorvall SS34转头（或与之相当的转法）以8000转/ 分离心５分钟，浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
８）将－22.86cm的巴期德吸管放入装有步骤２）制备的CsCl的离心管中， 吸头应接触管底。用吸管小心地将步骤７所制备的清亮红色溶液（来自浮渣之下）加入管内，使样本层位CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情步骤１）中制备的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添满离心管，封口。
９）将封口的管，（与相应的平衡管一起）放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13转头（或与之相当的转头中），于20℃以60 000转/分将密度梯度离心６小时。

10）回收闭环质粒ＤＮＡ区带
（三）从经过纯化的质粒ＤＮＡ中去除溴化乙锭
　　下面方法对于从经过氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心纯化的ＤＮＡ中去除溴化乙锭都同样奏效。
方法：有机溶剂抽提
小心：溴化乙锭是一种强诱变剂，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。用后这些溶液应用后述的方法进行净化处理。
１）将ＤＮＡ溶液放入玻璃或塑料管中，加等体积的水饱和１－丁醇或异戊醇。
２）振荡混合两相。
３）用台式离心机于室温以1500转/分离心３分钟。
４）用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内。
５）反复抽提[步骤１）－４）]４－６次直到粉红色从水相和有机相中均消失。
６）用以下任意一种方法从ＤＮＡ溶液中除CsCl：通过微量浓缩器（Amicon）进行旋转透析，对TE(pH8.0)透析24-48小时，并换液数次或者用３倍体积水进行稀释并于４℃用２倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的６倍）沉淀Ｄ15分钟，再于４℃以10 000g 离心15 分钏， 将沉淀的ＤＮＡ溶于约1ml TE(pH8.0)中。如将ＤＮＡ的乙醇溶液置于-20℃，CsCl会沉淀。
７）测定ＤＮＡ终溶液的ＯＤ260值，计算ＤＮＡ的浓度， 将ＤＮＡ分成小份贮存于-20℃。如果终制备的ＤＮＡ含有显著量的溴化乙锭（依颜色判断），可用酚、酚：氯仿各抽提１次，然后用乙醇沉淀ＤＮＡ。
（四）溴化乙锭溶液的净化处理　
　　小心：溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理。
１．溴化乙锭浓溶液（即浓度>0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液）的净化处理
　　方法： 用少门氏菌－微粒体测定表明， 本方法（Lunn 和Sanaone,1987）可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右。
１）加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。
２）加入0.2体积新配制的５％次磷酸和0.12体各新配制的0.5mol/L 亚硝酸钠，混匀。

切记：检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50％溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。
３）于室温温育24小时后，加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。至些， 该溶液可予丢弃。返回

切记：检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50％溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。
３）于室温温育24小时后，加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。至些， 该溶液可予丢弃。

(五）从质粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ
　　对于某些用途（例如用ＢＡＬ31进生活化或用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酥标记质粒ＤＮＡ的限制切片段的５'端），必须获得无ＲＮＡ污染的ＤＮＡ制品。尽管在通过氯化铯－化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒ＤＮＡ中，这样的ＲＮＡ污染物的重量微不卟道，但对说来，其中的ＲＮＡ分子数却可能相当可观，并可在限制酶消化反应的全部５'端中占据砂容忽视的比例。通过下述方法，可以从质粒制品中去除ＲＮA 。

２．通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析
１）制备质粒ＤＮＡ。
２）有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提１次。
３）将至多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1％ＳＤＳ平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。
４）将ＤＮＡ装入层柱并在柱的上部连接上含0.1％ＳＤＳ的TE(pH8.0)的贮液瓶，立即开始以0.5ml流出液为１流进行收集。
５）当收集到15份时，关闭柱底部，为明确质粒ＤＮＡ的分布情况，可心众每份收集物中取10μg样品，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光（见附录Ｅ）进行分析。
６）将含质粒ＤＮＡ的组成合并在一起，加２倍体积的乙醇于４℃沉淀10分钟，然后于４℃以大于10 000g离心15分钟，以回收ＤＮＡ。