凝胶层析技术
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凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10 到G200 ，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。
（一）原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
（二）葡聚糖凝胶的种类与性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
表 Sephadex1的种类与特性
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型号
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分离范围
（分子量）
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吸水量
（ml/g）
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最小溶胀时（h）
20℃～25℃ 100℃
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床体积（ml）/干凝胶（mg）
|
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G10
|
＜700
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1.0±0.1
|
3 1
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2~3
|
|
G15
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＜1 500
|
1.5±0.2
|
3 1
|
2.5~3.5
|
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G25
|
＜5 000
|
2.5±0.2
|
3 1
|
4~6
|
|
G50
|
1500～20 000
|
8.0±0.3
|
3 1
|
9~11
|
|
G75
|
3 000～70 000
|
7.5±0.5
|
24 1
|
12~15
|
|
G100
|
4 000～15 000
|
10.0±1.0
|
72 1
|
15~20
|
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G150
|
5 000～800 000
|
15.0±1.5
|
72 1
|
20~30
|
|
G200
|
5 000～30 0000
|
20.0±2.0
|
72 1
|
30~40
|
G25 、G50 有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75 ～ G200 又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。
表 DEAE－纤维素与Sephadex1比较
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项 目
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DEAE纤维素
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Sephadex
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交换量
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小
|
较大
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非特异性吸附
|
较大
|
小
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分离纯度
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较好
|
好
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分离时间
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较粗
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较长
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应用范围
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较窄
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较宽
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预处理
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繁琐
|
方便
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（三）试验方法
1．凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28 或G500 ，G250 多用于分离蛋白质单体，G200 多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
2．凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。
表 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
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层析柱规格
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凝胶的规格和用量（g）
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直径（cm）
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高（cm）
|
容量（ml）
|
G25
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G50
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G100
|
G200
|
|
0.9
|
15
|
9.5
|
2.5
|
1
|
0.6
|
0.3
|
|
0.9
|
30
|
19
|
5
|
2
|
1.2
|
0.6
|
|
0.9
|
60
|
38
|
10
|
4
|
2.5
|
1.2
|
|
1.6
|
20
|
40
|
10
|
4
|
2.5
|
1.2
|
|
1.6
|
40
|
80
|
20
|
8
|
5.0
|
2.4
|
|
1.6
|
70
|
140
|
35
|
14
|
9.0
|
4.4
|
|
1.6
|
100
|
200
|
50
|
20
|
12.5
|
6
|
|
2.6
|
40
|
210
|
50
|
20
|
12
|
7
|
|
2.6
|
70
|
370
|
90
|
35
|
20
|
12
|
|
2.6
2.6
|
100
60
|
530
1 000
|
130
250
|
50
110
|
30
70
|
17
35
|
为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。
3．装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
装柱过程基本同离子交换层析柱。
4．加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5．洗脱液收集 同离子交换层析。
6．凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：
⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2 N3 或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。
⑶ 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。
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