凝胶层析技术

互联网2013-11-15

1824

凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G₁₀ 到G₂₀₀ ，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。

（一）原理

凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。

（二）葡聚糖凝胶的种类与性能

葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。

表 Sephadex1的种类与特性

型号	分离范围（分子量）	吸水量（ml/g）	最小溶胀时（h） 20℃～25℃ 100℃	床体积（ml）/干凝胶（mg）
G₁₀	＜700	1.0±0.1	3 1	2~3
G₁₅	＜1 500	1.5±0.2	3 1	2.5~3.5
G₂₅	＜5 000	2.5±0.2	3 1	4~6
G₅₀	1500～20 000	8.0±0.3	3 1	9~11
G₇₅	3 000～70 000	7.5±0.5	24 1	12~15
G₁₀₀	4 000～15 000	10.0±1.0	72 1	15~20
G₁₅₀	5 000～800 000	15.0±1.5	72 1	20~30
G₂₀₀	5 000～30 0000	20.0±2.0	72 1	30~40

G₂₅ 、G₅₀ 有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G₇₅ _～ G₂₀₀ 又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。

表　DEAE－纤维素与Sephadex1比较

项目	DEAE纤维素	Sephadex
交换量	小	较大
非特异性吸附	较大	小
分离纯度	较好	好
分离时间	较粗	较长
应用范围	较窄	较宽
预处理	繁琐	方便

（三）试验方法

1．凝胶的选择根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G₂₈ 或G₅₀₀ ，G₂₅₀ 多用于分离蛋白质单体，G₂₀₀ 多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。

2．凝胶的预处理称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。

表　凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量

层析柱规格	凝胶的规格和用量（g）
直径（cm）	高（cm）	容量（ml）	G₂₅	G₅₀	G₁₀₀	G₂₀₀
0.9	15	9.5	2.5	1	0.6	0.3
0.9	30	19	5	2	1.2	0.6
0.9	60	38	10	4	2.5	1.2
1.6	20	40	10	4	2.5	1.2
1.6	40	80	20	8	5.0	2.4
1.6	70	140	35	14	9.0	4.4
1.6	100	200	50	20	12.5	6
2.6	40	210	50	20	12	7
2.6	70	370	90	35	20	12
2.6 2.6	100 60	530 1 000	130 250	50 110	30 70	17 35

为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。

3．装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。

装柱过程基本同离子交换层析柱。

4．加样与洗脱样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。

洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。

5．洗脱液收集同离子交换层析。

6．凝胶柱的重复使用与保存当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：

⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N₂ N₃ 或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。

⑶ 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。