凝胶层析法-PPO粗酶液的纯化

葡聚糖凝胶SephadexG-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，将不同分子大小的物质分离开。（G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质）。

PPO粗酶液
Tris-HCL缓冲液 NaCL 聚已二醇 DEAE-纤维素DE52
试管 试管架 烧杯 玻璃搅棒 移液管 滴管 试剂瓶 层析柱 pH计 恒流泵 梯度混合仪 核酸蛋白监测仪 GL-20C高速冷冻离心机 DL-7A大容量低速冷冻离心机

葡糖糖凝胶过滤层析法

1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡

(1)柱材处理

称取一定量的SephadexG-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。

(2)装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。

(3)平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝胶。

2．上样：将粗酶液上柱。

3．洗脱：用0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001MEDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

4．测定酶活性和蛋白质浓度。

0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml。

调节PPO表达是未来研究热点．一方面因为受伤或衰老会导致黑色素的形成，负调节PPO能大量提高作物的质量。另一方面PPO的过度表达能减少害虫对作物的侵害，或通过影响植物蛋白形成抗营养机制，或在毛状体渗出液中通过它启动聚合作用捕获昆虫。因此负调节PP0表达或调节PPO使其过度表达在生产及应用方面都具有很好的前景及重要的实际意义。