免疫球蛋白提取 (Immunoglobulin isolation)：IgG的分离与提纯

（一）材料与试剂配制

 

1 ．动物血清

2 ．硫酸铵饱和溶液

硫酸铵 800g~850g

H 2 O 1 000ml

加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以 28 ％ NH 4 OH 调 pH 至 7.0 （不调 pH 值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入 H 2 S ，静置过夜后滤过，加热蒸发 H 2 S 即可。

3 ． 0.01Mol/L pH7.4PB 液

A 液： 0.10Mol/L NaH 2 PO 4 液

NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 15.60g

加 H 2 O 至 1 000.ml

B 液： 0.10Mol/L Na 2 HPO 4 液

Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 35.80g

加 H 2 O 至 1 000ml

取 A 液 19ml ， B 液 81ml 加水至 1 000ml 即可。

4 ． 1 ％ BaCl 2 溶液

5 ．纳氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加 H 2 O 至 500.00ml

溶化后过滤，然后再加 20 ％ NaOH500.00ml ，混合即可。

6 ． 0.50 Mol/L 的 HCl 液和 0.50 Mol/L 的 NaOH 液。

7 ．洗脱液： 0.03Mol/L 的 NaCl 液。

8 ．透析袋（或玻璃纸）。

（二）操作方法

 

1 ．取 20ml 血清，加生理盐水 20ml ，再逐滴加入 (NH₄ )₂ SO 4 饱和溶液 10ml ，使成 20 ％ (NH₄ )₂ SO 4 溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置 30min 。

2 ． 3 000r/min 离心 20min ，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

3 ．在上清液中再加（ NH 4 ） ₂ SO 4 饱和溶液 30ml ，使成 50 ％（ NH 4 ） ₂ SO 4 溶液，充分混合，静置 30min 。

4 ． 3 000r/min 离心 20min ，弃上清。

5 ．于沉淀中加 20ml 生理盐水，使之溶解，再加 (NH₄ )₂ SO 4 饱和溶液 10ml ，使成 33 ％ (NH₄ )₂ SO 4 溶液，充分混合后，静置 30min 。

6． 3 000r/min 离心 20min ，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤 5 ， 2~3 次。

7． 用 10ml 生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

8． 透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于 4 ℃ 透析 24h ，中间换液数次。

以 1 ％ BaCl 2 检查透析液中的 SO 4 ^2- 或以纳氏试剂检查 NH 4 （取 3~4ml 透析液，加试剂 1~2 滴，出现砖红色即认为有 NH 4 存在），直至无 SO 4 ^2- 或 NH 4 出现为止。也可采用 SephadexG25 或电透析除盐。

9． 离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提 IgG （即 γ 球蛋白，如以 36 ％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白， Euglobin ，含 γ球蛋白) 。

10 ．过 DEAE －纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以 0.01Mol/L pH7.4PBS （ 0.03Mol/L NaCl ）洗脱，收集洗脱液。

也可采用 SephadexG150 或 G200 柱。

11 ．蛋白质及其定量鉴定（见本章第八节）。

12 ． IgG 的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。

⑴ 区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在 γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度 （ NH 4 ） 2 SO 4 盐析样品进行电泳，以资比较。

⑵ 琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该 IgG 免疫异种动物所获的抗 IgG 血清。将 IgG 与抗 IgG 血清进行双相双扩散，如 IgG 提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

⑶ 免疫电泳鉴定：（操作见第三章免疫电泳部分）。孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗 IgG 血清，琼脂扩散 24h ，观察结果。如果提取的 IgG 纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于 γ —球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。

⑷ 圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的 IgG 则只有一条区带。

13 ． IgG 的浓缩与保存

⑴ IgG 的浓缩：参看本章第九节。

⑵ IgG 的保存：一般浓缩至 1 ％以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加 0.01 ％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。

（三）IgG 的简易快速提取法

 

应用硫酸铵盐析及 DEAE- 纤维素层析法提纯化的 IgG ，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取 IgG 时，则往往采取下列的简易办法。

1． DEAE- 纤维素直接提取法

取样品直接过 DEAE- 纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。

⑴ 以一定数量的 DEAE52 放入烧杯中，加入 0.01Mol/L pH8.0PB 缓冲液，静置 30min ，去上清细粒，再重复一次。

⑵用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤。

 

⑶以 5g 湿重的 DEAE- 纤维素加 1ml 血清及 3ml 蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。

 

⑷于 4 ℃ 中放置 1h ，中间搅拌数次。

 

⑸用布氏漏斗抽滤，再用 0.01Mol/L pH8.0PB 缓冲液冲洗纤维素，抽滤。滤液即为提取的 IgG 液。

 

2 ． DEAE － SephadexA － 50 为弱碱性阴离子交换剂，经 NaOH 将 Cl^- 型转变为 OH^- 型后，可吸附酸性蛋白，血清中除 γ － G 属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的 pH 在 6.5 时，酸性蛋白均被 DEAE － SephadexA － 50 吸附，只有 γ － G 留在溶液中。因此利用这一原理可以提取 γ － G 。这种提取法流程大大缩短，纯化前后样品体积变化不大，而且所得 γ － G 无变性现象。经过四次处理，其纯度也较好。缺点是收集量少，损耗大。

⑴ DEAE — SephadexA — 50 的处理。取 DEAE － SephadexA － 50 若干克，悬浮于蒸馏水中， 1h 后倾去上层小颗粒，然后用 0.50Mol/L NaOH 处理 1h ，蒸馏水洗至中性，再用 0.5 Mol/L HCl 处理 0.5h ，水洗至中性，最后以 0.01Mol/L pH6.5PB 液平衡、抽干。

⑵ 取一定的血清量，加等量的 0.01Mol/L pH6.5PB 液，再加液体体积 1/4 的滤干的 DEAE － SephadexA － 50 ，混合、 4 ℃ 放置 1h ，不时搅拌、抽滤、收集滤液。

⑶ 再用同样重量的 DEAE － SephadexA － 50 处理滤液。反复处理三次。（全程共四次）。获得滤液即为 γ － G 制品。

⑷ DEAE － SephadexA － 50 的回收。用 0.5Mol/L 的 Na 2 HPO 4 洗脱，抽滤至滤液中无蛋白（ OD₂₈₀ ﹤ 0.04 ）后，再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。

（四）禽血清IgG 的分离与提纯（Na2SO4 法）

 

1 ．试剂

⑴ 5 ％葡聚糖硫酸盐

⑵ 0.02Mol/L MnCl₂ 溶液

⑶ 无水硫酸钠

⑷ pH8.2 硼酸盐缓冲液

⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB 液

2 ．操作方法

⑴ 取禽血清 10ml 加 5 ％葡聚糖硫酸盐液， 0.40ml 和 0.025Mol/L MnCl₂ 1.00ml 充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。

⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含 0.18g ，缓慢加入，混匀，静置 30min ， 3 000r/min 离心去上清。

⑶ 以 pH8.2 硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成 0.16g ／ ml ，同上法离心去上清。

⑷ 重复步骤⑶，加 Na₂ SO₄ ，使成 0.14g /ml 。

⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐 48h 。

⑹ 过 SephadexG200 柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是 IgM ，第二峰主要是 IgG 。

⑺ 如要进一步提纯，则用第二峰再过 DEAE —纤维素柱，以 0.06Mol/L pH7.4 PB 液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为 IgG 。

也可以按以下操作方法进行：

⑴ 以 18 ％硫酸钠（ W/V ）提取一次，再以 14 ％的硫酸钠提取一次。

⑵ 将粗提的免疫球蛋白以 PBS 溶解，按 9 ％加入无水硫酸钠，离心。再将上清按 5 ％加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中 4 ℃ 透析，直至无 SO 4 ^2- 为止。

⑶ 离心将上清液以 pH8.0 0.20Mol/L PBS 液平衡。

⑷ 过 SephadexG200 柱，以 pH8.0 0.20Mol/L PBS 液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡 IgG 。