免疫球蛋白提取 (Immunoglobulin isolation):IgG的分离与提纯
互联网
(一)材料与试剂配制
<font>1</font> .动物血清
<font>2</font> .硫酸铵饱和溶液
硫酸铵 <font><span> </span> 800g~<chmetcnv>850g</chmetcnv> </font>
<font><span>H</span> <span>2</span> <span>O<span> </span> 1 000ml</span> </font>
加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以 <font>28</font> % <font><span>NH</span> <span>4</span> <span>OH</span> </font> 调 <font>pH</font> 至 <font>7.0</font> (不调 <font>pH</font> 值也可以)。
注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入 <font><span>H</span> <span>2</span> <span>S</span> </font> ,静置过夜后滤过,加热蒸发 <font><span>H</span> <span>2</span> <span>S</span> </font> 即可。
<font>3</font> . <font>0.01Mol/L pH7.4PB</font> 液
<font>A</font> 液: <font><span>0.10Mol/L NaH</span> <span>2</span> <span>PO</span> <span>4</span> </font> 液
<font><span>NaH</span> <span>2</span> <span>PO</span> <span>4</span> </font> · <font><span>2H</span> <span>2</span> <span>O<span> </span> <span> </span> <chmetcnv>15.60g</chmetcnv> </span> </font>
加 <font><span>H</span> <span>2</span> <span>O</span> </font> 至 <font><span> </span> 1 000.ml</font>
<font>B</font> 液: <font><span>0.10Mol/L Na</span> <span>2</span> <span>HPO</span> <span>4</span> </font> 液
<font><span>Na</span> <span>2</span> <span>HPO</span> <span>4</span> </font> · <font><span>12H</span> <span>2</span> <span>O <span> </span> <span> </span> <chmetcnv>35.80g</chmetcnv> </span> </font>
加 <font><span>H</span> <span>2</span> <span>O</span> </font> 至 <font><span> </span> 1 000ml</font>
取 <font>A</font> 液 <font>19ml</font> , <font>B</font> 液 <font>81ml</font> 加水至 <font>1 000ml</font> 即可。
<font>4</font> . <font>1</font> % <font><span>BaCl</span> <span>2</span> </font> 溶液
<font>5</font> .纳氏液
<font>HgI<span> </span> <chmetcnv>115.00g</chmetcnv> </font>
<font>KI<span> </span> <chmetcnv>80.00g</chmetcnv> </font>
加 <font><span>H</span> <span>2</span> <span>O</span> </font> 至 <font><span> </span> 500.00ml</font>
溶化后过滤,然后再加 <font>20</font> % <font>NaOH500.00ml</font> ,混合即可。
<font>6</font> . <font>0.50 Mol/L</font> 的 <font>HCl</font> 液和 <font>0.50 Mol/L</font> 的 <font>NaOH</font> 液。
<font>7</font> .洗脱液: <font>0.03Mol/L</font> 的 <font>NaCl</font> 液。
<font>8</font> .透析袋(或玻璃纸)。
(二)操作方法
<font>1</font> .取 <font>20ml</font> 血清,加生理盐水 <font>20ml</font> ,再逐滴加入 <font><span>(NH<sub>4</sub> )<sub>2</sub> SO</span> <span>4</span> </font> 饱和溶液 <font>10ml</font> ,使成 <font>20</font> % <font><span>(NH<sub>4</sub> )<sub>2</sub> SO</span> <span>4</span> </font> 溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置 <font>30min</font> 。
<font>2</font> . <font>3 000r/min</font> 离心 <font>20min</font> ,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。
<font>3</font> .在上清液中再加( <font><span>NH</span> <span>4</span> </font> ) <font><sub><span>2</span> </sub> <span>SO</span> <span>4</span> </font> 饱和溶液 <font>30ml</font> ,使成 <font>50</font> %( <font><span>NH</span> <span>4</span> </font> ) <font><sub><span>2</span> </sub> <span>SO</span> <span>4</span> </font> 溶液,充分混合,静置 <font>30min</font> 。
<font>4</font> . <font>3 000r/min</font> 离心 <font>20min</font> ,弃上清。
<font>5</font> .于沉淀中加 <font>20ml</font> 生理盐水,使之溶解,再加 <font><span>(NH<sub>4</sub> )<sub>2</sub> SO</span> <span>4</span> </font> 饱和溶液 <font>10ml</font> ,使成 <font>33</font> % <font><span>(NH<sub>4</sub> )<sub>2</sub> SO</span> <span>4</span> </font> 溶液,充分混合后,静置 <font>30min</font> 。
<font><span><span>6.<span> </span> </span> </span> <span>3 000r/min</span> </font> 离心 <font>20min</font> ,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤 <font>5</font> , <font>2~3</font> 次。
<font>7.<span> </span> </font> 用 <font>10ml</font> 生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。
<font>8.<span> </span> </font> 透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于 <chmetcnv><span><font>4</font> </span> <span>℃</span> </chmetcnv> 透析 <font>24h</font> ,中间换液数次。
以 <font>1</font> % <font><span>BaCl</span> <span>2</span> </font> 检查透析液中的 <font><span>SO</span> <span>4</span> <sup><span>2-</span> </sup> </font> 或以纳氏试剂检查 <font><span>NH</span> <span>4</span> <sup><span> </span> </sup> </font> (取 <font>3~4ml</font> 透析液,加试剂 <font>1~2</font> 滴,出现砖红色即认为有 <font><span>NH</span> <span>4</span> <sup><span> </span> </sup> </font> 存在),直至无 <font><span><span> </span> SO</span> <span>4</span> <sup><span>2-</span> </sup> </font> 或 <font><span>NH</span> <span>4</span> <sup><span> </span> </sup> </font> 出现为止。也可采用 <font>SephadexG25</font> 或电透析除盐。
<font>9.<span> </span> </font> 离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提 <font>IgG </font> (即 γ 球蛋白,如以 <font>36</font> %的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白, <font>Euglobin</font> ,含 γ球蛋白) 。
<font>10</font> .过 <font>DEAE</font> -纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以 <font>0.01Mol/L pH7.4PBS</font> ( <font>0.03Mol/L NaCl</font> )洗脱,收集洗脱液。
也可采用 <font>SephadexG150</font> 或 <font>G200</font> 柱。
<font>11</font> .蛋白质及其定量鉴定(见本章第八节)。
<font>12</font> . <font>IgG</font> 的纯度鉴定 <font> </font> 可采用下列方法之一鉴定。
⑴ <font> </font> 区带电泳:玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在 γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度 ( <font><span>NH</span> <span>4</span> </font> ) <font><span>2</span> <span>SO</span> <span>4</span> </font> 盐析样品进行电泳,以资比较。
⑵ <font> </font> 琼脂双相双扩散鉴定:预先准备该 <font>IgG</font> 免疫异种动物所获的抗 <font>IgG</font> 血清。将 <font>IgG</font> 与抗 <font>IgG</font> 血清进行双相双扩散,如 <font>IgG</font> 提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
⑶ <font> </font> 免疫电泳鉴定:(操作见第三章免疫电泳部分)。孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗 <font>IgG</font> 血清,琼脂扩散 <font>24h</font> ,观察结果。如果提取的 <font>IgG</font> 纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于 γ —球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。
⑷ <font> </font> 圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的 <font>IgG</font> 则只有一条区带。
<font>13</font> . <font>IgG</font> 的浓缩与保存
⑴ <font> IgG</font> 的浓缩:参看本章第九节。
⑵ <font> IgG</font> 的保存:一般浓缩至 <font>1</font> %以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加 <font>0.01</font> %硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。
(三)<font><span>IgG</span> 的简易快速提取法</font>
应用硫酸铵盐析及 <font>DEAE-</font> 纤维素层析法提纯化的 <font>IgG</font> ,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足,特别是当大量提取 <font>IgG</font> 时,则往往采取下列的简易办法。
<font><span><span>1.<span> </span> </span> </span> <span>DEAE-</span> </font> 纤维素直接提取法
取样品直接过 <font>DEAE-</font> 纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。
⑴ <font> </font> 以一定数量的 <font>DEAE52</font> 放入烧杯中,加入 <font>0.01Mol/L pH8.0PB</font> 缓冲液,静置 <font>30min</font> ,去上清细粒,再重复一次。
⑵用布氏漏斗(内放两层滤纸)过滤。
⑶以 <chmetcnv><span><font>5g</font> </span> </chmetcnv> 湿重的 <font>DEAE-</font> 纤维素加 <font>1ml</font> 血清及 <font>3ml</font> 蒸馏水混合液的比例,加入各成分,充分搅拌。
⑷于 <chmetcnv><span><font>4</font> </span> <span>℃</span> </chmetcnv> 中放置 <font>1h</font> ,中间搅拌数次。
⑸用布氏漏斗抽滤,再用 <font>0.01Mol/L pH8.0PB</font> 缓冲液冲洗纤维素,抽滤。滤液即为提取的 <font>IgG</font> 液。
<font>2</font> . <font>DEAE</font> - <font>SephadexA</font> - <font>50</font> 为弱碱性阴离子交换剂,经 <font>NaOH</font> 将 <font>Cl<sup>-</sup> </font> 型转变为 <font>OH<sup>-</sup> </font> 型后,可吸附酸性蛋白,血清中除 γ - <font>G</font> 属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的 <font>pH</font> 在 <font>6.5</font> 时,酸性蛋白均被 <font>DEAE</font> - <font>SephadexA</font> - <font>50</font> 吸附,只有 γ - <font>G</font> 留在溶液中。因此利用这一原理可以提取 γ - <font>G</font> 。这种提取法流程大大缩短,纯化前后样品体积变化不大,而且所得 γ - <font>G</font> 无变性现象。经过四次处理,其纯度也较好。缺点是收集量少,损耗大。
⑴ <font> DEAE</font> — <font>SephadexA</font> — <font>50</font> 的处理。取 <font>DEAE</font> - <font>SephadexA</font> - <font>50</font> 若干克,悬浮于蒸馏水中, <font>1h</font> 后倾去上层小颗粒,然后用 <font>0.50Mol/L NaOH</font> 处理 <font>1h</font> ,蒸馏水洗至中性,再用 <font>0.5 Mol/L HCl</font> 处理 <font>0.5h</font> ,水洗至中性,最后以 <font>0.01Mol/L pH6.5PB</font> 液平衡、抽干。
⑵ <font> </font> 取一定的血清量,加等量的 <font>0.01Mol/L pH6.5PB</font> 液,再加液体体积 <font>1/4</font> 的滤干的 <font>DEAE</font> - <font>SephadexA</font> - <font>50</font> ,混合、 <chmetcnv><span><font>4</font> </span> <span>℃</span> </chmetcnv> 放置 <font>1h</font> ,不时搅拌、抽滤、收集滤液。
⑶ <font> </font> 再用同样重量的 <font>DEAE</font> - <font>SephadexA</font> - <font>50</font> 处理滤液。反复处理三次。(全程共四次)。获得滤液即为 γ - <font>G</font> 制品。
⑷ <font> DEAE</font> - <font>SephadexA</font> - <font>50</font> 的回收。用 <font>0.5Mol/L</font> 的 <font><span>Na</span> <span>2</span> <span>HPO</span> <span>4</span> </font> 洗脱,抽滤至滤液中无蛋白( <font>OD<sub>280</sub> </font> ﹤ <font>0.04</font> )后,再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。
(四)禽血清<font><span>IgG</span> 的分离与提纯(<span>Na2SO4</span> 法)</font>
<font>1</font> .试剂
⑴ <font> 5</font> %葡聚糖硫酸盐
⑵ <font> 0.02Mol/L MnCl<sub>2</sub> </font> 溶液
⑶ <font> </font> 无水硫酸钠
⑷ <font> pH8.2</font> 硼酸盐缓冲液
⑸ <font> 0.06Mol/L pH7.4PB</font> 液
<font>2</font> .操作方法
⑴ <font> </font> 取禽血清 <font>10ml</font> 加 <font>5</font> %葡聚糖硫酸盐液, <font>0.40ml</font> 和 <font>0.025Mol/L MnCl<sub>2</sub> 1.00ml</font> 充分混合,静置,然后离心去沉淀,此步目的是为了去掉脂类物质。
⑵ <font> </font> 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含 <chmetcnv><span><font>0.18g</font> </span> </chmetcnv> ,缓慢加入,混匀,静置 <font>30min</font> , <font>3 000r/min</font> 离心去上清。
⑶ <font> </font> 以 <font>pH8.2</font> 硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成 <chmetcnv><span><font>0.16g</font> </span> </chmetcnv> / <font>ml</font> ,同上法离心去上清。
⑷ <font> </font> 重复步骤⑶,加 <font>Na<sub>2</sub> SO<sub>4</sub> </font> ,使成 <font><chmetcnv><span>0.14g</span> </chmetcnv> <span>/ml</span> </font> 。
⑸ <font> </font> 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀,然后装透析袋除盐 <font>48h</font> 。
⑹ <font> </font> 过 <font>SephadexG200</font> 柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是 <font>IgM</font> ,第二峰主要是 <font>IgG</font> 。
⑺ <font> </font> 如要进一步提纯,则用第二峰再过 <font>DEAE</font> —纤维素柱,以 <font>0.06Mol/L pH7.4 PB</font> 液洗脱,洗脱下来的蛋白液即为 <font>IgG</font> 。
也可以按以下操作方法进行:
⑴ <font> </font> 以 <font>18</font> %硫酸钠( <font>W/V</font> )提取一次,再以 <font>14</font> %的硫酸钠提取一次。
⑵ <font> </font> 将粗提的免疫球蛋白以 <font>PBS</font> 溶解,按 <font>9</font> %加入无水硫酸钠,离心。再将上清按 <font>5</font> %加入无水硫酸钠,离心。将两沉淀溶解、混合,在常水中透析过夜,再在生理盐水中 <chmetcnv><span><font>4</font> </span> <span>℃</span> </chmetcnv> 透析,直至无 <font><span>SO</span> <span>4</span> <sup><span>2-</span> </sup> </font> 为止。
⑶ <font> </font> 离心将上清液以 <font>pH8.0 0.20Mol/L PBS</font> 液平衡。
⑷ <font> </font> 过 <font>SephadexG200</font> 柱,以 <font>pH8.0 0.20Mol/L PBS</font> 液洗脱,收集洗脱液,取第二峰即为鸡 <font>IgG</font> 。