实时荧光定量PCR原理

　　所谓实时荧光定量PCR 技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. 在荧光定量PCR 技术中，有一个很重要的概念—— Ct 值。C 代表Cycle ，t 代表threshold ，Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold ）的设定

 

PCR 反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：threshold = 10 ´ SD_{cycle 6-15}
3. Ct 值与起始模板的关系

 

研究表明，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct 值。因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

 

4. 荧光化学
　　荧光定量PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
　　 1 ）TaqMan 荧光探针：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的5 ’ －3 ’ 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。

 

2 ）SYBR 荧光染料：

 

　　在PCR 反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。