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实时荧光定量PCR!!

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实时荧光定量PCR

一种科学准确的定量方法

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。

一. 实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. Ct 值的定义

在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

2. 荧光域值(threshold)的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10 ´ SDcycle 6-15

3. Ct值与起始模板的关系

研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

4. 荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理简述如下:

1)TaqMan荧光探针:

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

2)SYBR荧光染料:

在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

二.内标在传统定量中的意义

1.几种传统定量PCR方法简介〔3〕:

1)内参照法:

在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板〔4〕。

2)竞争法:

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。

扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数〔5〕。

3)PCR-ELISA法:

利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的〔6〕。

2.内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。

同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验,所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

三.内标对荧光定量PCR的影响

1.实时荧光定量PCR无需内标

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:

1)Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。

2)Ct值与起始模板的线性关系

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

2.内标对实时荧光定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著〔7,8〕。

但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。

美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较,得出的结论是:内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的,而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方〔9〕。

Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准,可实现多色荧光同时检测,但定量检测仍然采用外标准曲线的方法,而不用内标进行定量。

综上所述,利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域〔10,11,12,13〕。

参考文献

1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.

2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. B Applied Biosystems

3. 定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用. 中华检验医学杂志2000, 23(2): 120-121.

4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reaction. J Pharmacol Toxicol Methods, 1997, 38: 133-140.

5. Wuhu A, Waiztu M, Koch A. A rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriprase (CRT) PCR analysis of cellular genes. Brain Pathol, 1998, 8: 13-18

6. 仝文斌,高巍,费然等. 核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法. 中华医学检验杂志,1999, 22: 83-86.

7. Actor JK, Limor JR, Hunter RL. A flexible bioluminescent-quantitive polymerase reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. J Clin Lab Anal, 1999, 13(1): 40-47.

8. Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR). J Theor Biol, 1997, 184(4): 433-440.

9. Ke LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol. Cell Probes, 2000, 14(2): 127-135.

10. Becker K., D. Pan and C.B.Whitely. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther, 1999, 10: 2559-2566.

11. Higgis, J.A., etal. 5’ nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits. J Clin Microbiol, 1998, 36: 2284-2288.

12. Bieche I., P.Oondy, etal. Real-time reverse transcription-PCR assay for future nagement of ERBB2-based clinical apolications. Clin.Chem, 1999, 45: 1148-1156.

13. Wang X. X. Li, etal. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. 2000,Neurosci.Res, 59(2): 238-46

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