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实时荧光定量PCR条件摸索

相关实验:反向 PCR (inverse-PCR)

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沁园12

第一次接触实时荧光定量PCR实验,有一些问题想向各位老师请教

1.预实验:①计划在预实验时摸索(细胞接种量、药物刺激浓度)以及cDNA稀释倍数(1:2、 1:4、 1:8各设两个复孔),引物特异性(看标准曲线、融解曲线、扩增曲线),延伸温度和延伸时间。不知道我计划摸索的条件是否均必要,或者预实验摸索条件主要是在哪些方面?大家一般都会设计两对不同的引物用于测试条件嘛?

2.对于同一细胞而言,检测不同基因表达,cDNA稀释倍数是否一致?还是每个基因检测时都需摸索对应的cDNA 稀释倍数?

3.正式 实验三次重复:我的想法是先培养同一代的三瓶细胞,三瓶细胞分别收集,然后接种于6孔板,每瓶细胞对应接种于对照组、C1组、C2组(各一个孔),之后每个孔所提的RNA反转为cDNA后,分为3个复孔上机检测。 不知道我这设计是不是相当于每组设置三个复孔,实验重复三次,或许有没有更好的设计方式,还请各位老师多多指教~

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4 个回答

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balalaLy

有帮助

cDNA稀释倍数不用太纠结,一般都是按照1:10或者1:20这样稀释,如果需要做的基因数量不是很多,就按1:10,最好按照固定的比例,比如逆转录用500ng或者1000ng的总RNA,然后用1:10这样的比例稀释cDNA,这样你不同批次的实验之间进行对比也比较合理

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汤姆卜丽波

有帮助

不同基因,稀释比是不一样的,要自己摸索,还有就是三次独立重复更严谨一点是要从培养细胞开始就不同,不是一批次

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天一湖医者

有帮助

对于同一细胞而言,检测不同基因表达,cDNA稀释倍数是不一致的。

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Eason老歌迷

有帮助

如何准确确定cDNA的稀释梯度:将 cDNA 做梯度稀释,把得到的不同梯度 cDNA 同时进行 qPCR,选择位于 15-33 范围内的 CT 值对应的 cDNA 稀释梯度作为最佳稀释梯度

使用 Nanodrop 测定一下 cDNA 的浓度,按照以往的经验值进行添加 cDNA,或者按照师兄师姐的 SOP 上写到的浓度进行添加。

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