反向 PCR （inverse-PCR）

一、限制性内切酶消化 1. 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。 2. 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下： 37℃ 过夜，电泳检测酶切效果。 二、回收DNA 1. 将

1、基于已知 DNA 序列，设计并合成寡聚核苷酸引物 1 和引物 2。2、用合适的限制性内切核酸酶（见以下注释）消化 2~5 μg DNA 模板（序列 10 bp）。用酚：氯仿提取消化后的 DNA，再用氯仿单独抽提。加 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2.5 倍体积的乙醇使 DNA 沉淀，离心回收沉淀，用 TE 缓冲液（pH8.0）溶解使浓度为 100 mg/mL。【选做步骤，DNA