qPCR探针怎么设计

（1）探针的 3' 端必须保护以防止其在 PCR 扩增时延伸。可以利用 3'-脱氧腺苷、2', 3'双脱氧核苷，插人 T 或猝火染料本身封闭 3'端的磷酸基。TAMRA 或另一个猝火物对 3'端 的标记可利用氨基衔接物实现。也可利用氨基衔接物在合成后以寡核苷酸标记。该法适 用于除 Cy3TM、Cy5TM、Cy5.5TM、HEX 和 TET 之外的所有染料。

（2）探针的 Tm 值应当比扩增引物的 Tm 值髙 10℃，在 65~72℃ 之间，因为此时 Tag 核 酸外切酶活性最高。

（3）避免探针的 5' 端结合一个 G 残基，因之将会在切割后仍猝灭报告物的荧光。

（4）探针中 G 碱基的含量不可多于 C 碱基。

（5）避免单核苷酸重复，特别是 G 残基。

（6）富含 AT 的序列要增加引物和探针的长度，以达到要求的：Tm 值。注意：探针超过 40bp 时会降低猝火效率和减少产量。

（7）探针退火时应尽可能靠近引物，但不要有重叠部分，与引物的 3'端应至少有一个碱 基的距离。

（8）如果 TaqMan 探针是用来区分等位基因的，建议将错配的核苷（多态性位点）放在 探针的中间，而不是末端。探针要尽可能短，以通过错配增加区别能力。

总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。

若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时;2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。

另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。

完整的探针包括荧光基团、淬灭基团和寡核苷酸序列三部分，理想的探针应该具有特异性高、荧光本底低等特点。对于寡核苷酸序列的设计一般遵循以下原则：

· GC含量30%-80%，C碱基要多于G碱基，长度一般15-30 bp。过长会影响淬灭效率，导致荧光本底较高；过短则导致特异性下降。

· Tm值一般比引物的要高5-10℃。

· 5’端不能安置G碱基。G碱基本身具有荧光淬灭的特性，会导致荧光基团被切掉后也无法发出荧光。

荧光基团根据检测的多重性灵活选择，一般首选常规的FAM和HEX，同时针对不同的荧光基团选择合适的淬灭基团（Tab 2）。淬灭基团一般首选BHQ系列。

设计策略：

1. 利用多重序列比对软件如 Clustal (http: //www. ebLac.uk/clustalw) 对所选序列进行多重比较。

Clustal 的使用教程，点击访问：序列比对之 Clustalx 与 Clustalw 使用指南

2. 推测比对中的保守区域。通过选择保守序列的每个位置上最常出现的核苷酸，导出 其共同引物。

3. 引物的结合位点应该完全位于保守区域内。对于亲缘关系较远的种，如果序列不是非常保守，可以设计匹配程度较低的探针或引物。引物的 5'端允许有一定的简并性，但 Y 端的错配将降低退火的特异性和 PCR 的产量（Sommer and Tautz 1989)。

4. 按照 PCR 引物设计的一般规律，避免近源种 PCR 中引物的错配和引物二聚体的 形成。