实时荧光定量PCR反应

两步法，三步法并没有本质区别，信号的读取都是在每一个延长结束后读取。定量PCR一开始的时候也是三步法的。

两步法，是因为设计引物的时候把退火温度设为酶的工作温度，而且定量PCR的产物都很短，需要的时候都短，所以两步法更方便。三步法的话，花的时间长，不利于快速实验。

如果引物设计时的Tm值接近60度(比如用ABI的primerexpress设计的引物),就直接用两步法;

如果Tm值不太符合两步法要求,即不接近60度,还是三步法好些!