层析试验方法

互联网2013-11-14

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阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。

1 ．剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液 pH 值下带电荷的种类选择，如 pH 高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下， DEAE- 纤维素用于分离酸性蛋白，而 CM 纤维素用于分离碱性蛋白质。

下面以 DEAE- 纤维素操作为例，介绍试验方法

2 ．膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露 DEAE- 纤维素上的极性基团。 DEAE- 纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是 1.0g DEAE- 纤维素相当于 6ml ～ 8ml 柱床体积。

称取所需的量，撒于 0.5Mol/L NaOH 溶液中（ 1g DEAE —纤维素干粉约需 15 倍 NaOH 液），浸泡 1h 左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于 0.5Mol/L HCl 中 1h ，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于 0.5Mol/L NaOH 液中，同样处理，洗至中性。

3 ．平衡 将 DEAE —纤维素放入 0.0lMol/L pH 7. 4 PB 液中（即起始缓冲液），静止 1h ，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的 pH 值与加入的 PB 液的 pH 值相近时为止。

4 ．装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为 10 ︰ 1 ～ 20 ︰ 1 ，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理 24h ，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。

装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的 DEAE －纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至 1ml/5min ，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的 pH 值与流入液的 pH 值完全一致为止。

5 ．上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（ 4 ℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加 1ml ～ 2ml 缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。

样品的加量与 DEAE —纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的 —球蛋白 50mg ～ 100mg ，用干重约 4g DEAE －纤维素装柱分离，可获得理想结果。

6 ．洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使 pH 逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。

7 ．洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以 20% 磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。

8 ．交换柱的再生 将使用过的 DEAE －纤维素移入烧杯中，用 2Mol/L NaCl 液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加 1/10 000 的叠氮钠防腐，保存于 4 ℃冰箱中。使用时，再以碱－酸－碱处理。