增殖型腺病毒系统
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1) 基因缺失突变
我们知道，细胞被病毒感染后的许多表现与细胞在发生癌变时出现的变化极其相似（如， p53 肿瘤抑制蛋白的失活等）。这就使利用基因敲除的方法使病毒在肿瘤细胞内有选择性地复制增殖成为可能。目前在这方面的研究可以分为两个发展方向：大段的基因敲除和有选择性地敲除腺病毒有效复制所必须且（或者）对正常细胞有毒性但在肿瘤细胞中却不需要的基因。前者中比较有代表性的是 E1B-55kD 区敲除的 ONYX-015 （又名 dl 1520 ， CI1042 ）。 Bischoff JR 教授认为：腺病毒在其生活周期中早期表达的蛋白 E1A 可以激活宿主细胞的 p53 途径使细胞凋亡， E1B-55KDa 蛋白可以阻断该途径，使腺病毒在宿主细胞内完成完整的生活周期。因此， E1B-55kDa 缺失的腺病毒感染 p53 功能正常的细胞后，其 E1A 激活宿主细胞的 p53 途径，该细胞将发生凋亡，病毒不能有效复制。而在 p53 功能异常的细胞（ 50% 左右肿瘤细胞的 p53 功能异常）内则可以复制增殖并最终将其裂解。虽然， ONYX-015 溶瘤的确切机制还有待于进一步的商榷，但在已结束的 II 期临床试验中，用 ONYX-015 联合常规化疗治疗头颈部肿瘤，显示出良好的抗肿瘤能力（总有效率 63% ，为迄今最有效的肿瘤生物治疗的临床报告之一）。与 dl 1520 这种大段的基因敲除不同，增殖型腺病毒Δ 24 及 dl 922-947 作为有选择性的基因敲除的代表，缺失的是腺病毒基因组中单一的保守区 E1A CR2(E1A conserved region 2) ，而对于其他有功能的部分并未触及，因此这两种病毒具有更好的靶向性，即 pRb 功能异常的细胞系（与 p53 途径一样，大多数的人类肿瘤细胞有 pRb 功能丢失的现象）；如果将野生型的 pRb 转导到 Rb- 的肿瘤细胞株内，则Δ 24 和 dl 922-947 复制明显受到抑制。无论是在体内还是在体外实验中， dl 922-947 的杀伤能力都明显强于 dl 1520 。在人类肿瘤的裸鼠移植模型上，经静脉途径给予 dl 922-947 更是获得了甚至超过野生型腺病毒的治疗效果。
2) 利用组织 / 肿瘤特异性启动子调控病毒的复制
许多肿瘤组织特异性启动子已被人类所认识，可将其分为三类：①针对所有肿瘤特征的启动子，如缺氧启动子、端粒酶启动子等；②针对个别肿瘤特征的启动子，如肝癌的甲胎蛋白（ AFP ）启动子、胃肠道肿瘤的癌胚抗原 (CEA) 启动子以及乳腺癌和卵巢癌的 DF3/MUC-1 启动子等；③针对某一类组织（必需不是至关重要的组织）特征的启动子，如前列腺特异性抗原（ PSA ）启动子等。将组织 / 肿瘤特异性启动子插入到病毒增殖必需基因的上游，可以在转录水平对病毒复制进行调控，使病毒靶向特定的组织。这一类病毒又被称为临时性增殖型病毒（ provisionally replicating virus ）近年来，对这方面的研究发展很快，几乎涉及到迄今发现的每种启动子。但研究发现，不同的启动子之间在特异性和对肿瘤 / 组织及病毒基因的调控活力方面参差不齐，因此在选择时应当慎重。比如 AFP 启动子和 DF3/MUC-1 启动子调控的临时性增殖型腺病毒分别被用于对肝细胞癌和表达 MUC-1 的乳腺癌的研究，均表现出很强的抗肿瘤活性，相反用 E2F 启动子 / 增强子对 E1A 进行调控却表现除出多种细胞和组织的靶向作用。应用这一策略最成功的例子来自美国的 Calydon 制药公司的 CN 706 。 1997 年， Rodriguez R 等人将人类 PSA 基因的启动子 / 增强子成功插入到 5 型腺病毒 E1A 区的上游，并将其命名为 CN706 ，这种通过 PSA 启动子 / 增强子调控的临时性增殖性腺病毒，在 LNCaP （一种经修饰的可产生 PSA 的细胞株）内可以复制增殖，并高水平地表达 E1A ，而在 DU145 （不产生 PSA 的人前列腺细胞株）内不增殖。对裸鼠移植瘤模型进行一次 CN706 瘤内注射后即不再有 PSA 产生。目前该病毒已进入对局部复发的前列腺癌患者的 I 期临床试验。这种策略中有一个较大的弱点，即真核细胞的启动子并不能在病毒的基因组中严格地控制转录，而只需有少量的病毒产物（如， E1A ）就足以满足病毒增殖的需要，这就无法达到特异性的目的。研究表明，将启动子与病毒的基因组 DNA 隔绝开来是解决这个问题的一个好方法。有人尝试将经过改造的带有特异性启动子的病毒基因调控盒子装入一个质粒载体中与转入细胞内，因为该载体只表达一次，病毒也就只能进行一轮复制。另外，用组织特异性启动子对两个（或更多）病毒复制必需基因进行调控，也是一种有效途径。比如， CN706 第二代产品 CV787 ，就是用两个 PSA 启动子 / 增强子分别控制腺病毒的 E1A 和 E1B 区，具有比 CN706 更好的靶向功能，目前也已经进入 I 期临床试验。
3) 对病毒外壳蛋白进行改造
腺病毒的感染过程包括三个贯序发生却又截然分开的过程，即粘附、内化和入核。任何一种成功的提高腺病毒载体靶向性的改造都应以不影响腺病毒的这三个过程为原则。腺病毒的粘附和内化过程分别与细胞表面的柯萨奇 - 腺病毒受体（ CAR ）和腺病毒五邻体表面的 RGD 小肽（精氨酸 - 甘氨酸 - 天门冬氨酸）有关。前者与腺病毒纤维蛋白的头部结合介导粘附过程，后者与细胞的整合素受体相互作用介导内化。基于以上的认识，人们设想通过对腺病毒外壳蛋白改造以提高其靶向性，这个过程又称为重新定靶（ retargeting ）。主要有以下几种方法：
① 应用双特异性抗体 该方案的思路是：构建一个双特异性抗体，其一端是针对腺病毒头部的单克隆抗体，另一端是一个可以与所靶向的肿瘤细胞表面的特异性受体结合的配体。 FGF2 （成纤维细胞生长因子）受体在包括胶质瘤、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞的表面有过度表达，因此构建两端分别为抗腺病毒头部单抗和 FGF2 的双特异性抗体可以使腺病毒靶向这些肿瘤细胞。这种治疗方案目前被用于对 Kaposi 肉瘤和卵巢癌的治疗，并正在进行 I 期临床试验。同样的方法也适用于在胶质瘤等多种肿瘤细胞表面高水平表达的 EGFR （表皮生长因子受体）。 Watkins 等人构建了一种 EGF 与抗腺病毒纤维结构但链抗体的融合蛋白用于胶质瘤的治疗。这种方法的不足之处在于：由于抗腺病毒头部的单抗与头部之间是通过非共价连接，静脉给药时很容易脱离。
② 对腺病毒纤维结构（或五邻体亚单位）的修饰 这种方法是对上一方法的改良，其策略是对腺病毒的纤维结构直接进行修饰，使其可以与肿瘤细胞表面的特异性受体结合。但进行这种改造时需要注意两点问题：首先，腺病毒的纤维结构是以三聚体的形式存在的，任何形式的修饰都应以不影响这种三聚体为原则；其次，经过修饰的纤维蛋白等同于配体，它应该能够被肿瘤细胞表面的特异性受体识别并与之结合。 Dmitriev 等人将 FLAG 肽插入 HI 环，发现不会影响腺病毒存活和增殖。其后他们将 RGD-4C 肽插入 HI 环，构成腺病毒载体 AdRGD ，该病毒可通过插入肽 RGD-4C 识别特异性受体，使 AdRGD 与靶细胞特异性地相互作用。由此获得非 CAR 依赖性腺病毒，使许多 CAR 阴性的肿瘤细胞系腺病毒感染率大幅度提高，这些肿瘤包括卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、头颈部鳞状细胞癌。
