癌症治疗中的增殖性腺病毒
丁香园论坛
2366
本人初来乍到，草译了一篇文献，供各位大虾批评，就图先混个脸熟。
癌症治疗中的增殖性腺病毒
Alemany R, Balague C, Curiel DT
（Replicative adenoviruses for cancer therapy.
Nat Biotechnol. 2000 Jul;18(7):723-7. Review. ）
摘要： 在癌症治疗领域取得的快速进展就是具有增殖活性的病毒。腺病毒是一种温和的致病性人类病毒，它可在多数人类癌症的起源细胞——上皮细胞中大量繁殖。当病毒学家掌握了有关其与细胞之间分子相互作用的很多细节之时，那些应用型科学家已经发展起来强有力的技术，来对每一个病毒蛋白进行遗传学上的改造和调节。紧接着，在癌症基因治疗方面取得的非增殖性腺病毒载体的有限的成就，使腺病毒溶瘤作用的古老概念重新引起世人注目。大多数的努力主要集中于，使肿瘤细胞中非必须的病毒功能缺失，或者以肿瘤特异性启动子调节病毒基因，从而获得病毒的选择性增殖。然而，人们所预计的病毒增殖选择性却没有实现，原因是对于复杂的病毒与细胞间的相互作用还不甚完全了解，以及病毒基因组中细胞启动子的遗失。对于病毒衣壳所进行的改造，使病毒的肿瘤靶向性得以实现，并且增强了其感染性。具有较大溶瘤潜能的细胞功能和病毒功能也得到了阐明。最后，病毒与机体免疫系统的相互影响，很可能预示着这种途径作为癌症治疗方法的成功。
病毒治疗的概念，即以病毒治疗癌症的方法，是受本世纪早期的一个偶然发现的启发而产生的，这就是感染了病毒或接受了疫苗接种的癌症患者所发生的肿瘤消退。随后很多不同类型的病毒作为肿瘤细胞的溶解剂进行了临床试验，但其较低的功效与毒性比使之被放弃。腺病毒在1953年被提纯后不久，因为其在人类上皮细胞系中呈增殖性生长，即被作为一种溶瘤制剂进行了试验。在早期的试验中，30例宫颈癌患者被注射了不同血清型的腺病毒，结果与其它病毒的试验相一致，即先发生肿瘤消退，紧接着出现肿瘤生长，相反地却伴有与抗病毒有关的免疫反应，缺少明显的治疗功效，使研究者们放弃了把腺病毒作为抗肿瘤制剂的尝试。
尽管如此，几种类型病毒作为有希望的抗肿瘤制剂，最近重又被提起。关于病毒与细胞相互作用的加深了解，主要集中于一些病毒对肿瘤细胞的自然趋向性。例如，呼肠病毒需要激活ras途径进行感染，而微小自主病毒的生活周期被限定在活跃增殖的细胞中。同样，单纯疱疹病毒Ⅰ型的几种自然或构建的突变体仅能在分裂细胞中增殖。基于对腺病毒与细胞周期调节蛋白的相互作用的加深了解，以及把腺病毒作为基因传递媒介来应用所得到的经验，腺病毒也是作为能被改造成具有亲瘤特性的病毒而出现的。尽管腺病毒的肿瘤选择性可在不同水平上得以解决，但是，集中了大多数努力的研究领域可能是发展有条件的增殖性腺病毒（CRAds），将其设计为仅限在肿瘤细胞内增殖。改善CRAds针对局部的和播散性疾病的传递，以及病毒在肿瘤内的传播，是正在成长中的研究领域。最后，相当重要的一点，对增殖性腺病毒与免疫系统相互作用的研究是必不可少的，目的是改善病毒溶瘤作用的效果。在此，我们综述了在这些不同水平上对增殖性腺病毒所进行的研究，为今后的研究提供一些见解。
一． 腺病毒的肿瘤选择性增殖
因为有了Onyx制药公司（Richmond CA）的领先努力，对于选择性在肿瘤细胞内增殖的腺病毒的研究和设计，成为以腺病毒为基础的癌症病毒治疗的最为集中的研究领域。在分析有关病毒选择性增殖的研究能得到些什么之前，先评论一下试验所采用的测定方法是有用的。
通过在体外比较不同得人类细胞系，CRAd选择性增殖被广泛地研究。不同的细胞系显示出对腺病毒感染和病毒繁殖的易感性水平有不同，但这些变量常常被忽视，这个缺点可以通过与非选择性腺病毒如野生型腺病毒（Adwt）的比较而得以纠正，虽然不是所有研究都兼顾了这个对照试验。体外CRAd的作用，在病毒DNA增殖、晚期基因表达、细胞死亡以及子代病毒产生水平上进行了测定，这些参数经常毫无关联。病毒DNA增殖、外壳六联体表达和细胞死亡在没有子代病毒产生时也可以发生。相反，在一些类型细胞中，如纤维母细胞和角质细胞，病毒的产生可以不伴有明显的细胞病变效应。因此，尽管结晶紫染色法、台盼蓝排除法以及其它存活与死亡细胞鉴别检测方法都让位于CRAd在每一类型细胞中的效应信息，但从溶瘤的观点出发，子代病毒的产生是最有意义的。此外，与通过反复冻融使病毒从细胞释放出来后在测定相比，释放到上清中的子代病毒预计可能具有更高的溶瘤价值。对于某一特定类型的细胞，每个细胞产生的病毒感染颗粒的释放数量即是子代病毒产生的定量测定方法。
也许以数学的概念表示CRAd在肿瘤细胞系与正常细胞系之间的选择性的最好最简单的方法是下面这个公式：
CRAd在肿瘤细胞中的释放数量 × Adwt在正常细胞中的释放数量
————————————————————————————————————
CRAd在正常细胞中的释放数量 Adwt在肿瘤细胞中的释放数量
用这个公式计算，假如CRAd在肿瘤细胞中产生1000pfu/细胞，在正常细胞产生1 pfu/细胞，而Adwt则分别产生10000和100 pfu/细胞，那么这个CRAd的肿瘤选择性就是Adwt的10倍。公式中Adwt的出现矫正了不同类型细胞之间病毒感染性和病毒繁殖方面的差异。另一方面，选择正常细胞也是必不可少的。人原始胚胎肾细胞是对腺病毒2型和5型感染最敏感的，在很多不同试验中应用的人纤维母细胞系和内皮细胞系，则显示出很低的感染性以及延迟的细胞病变效应。在一些其它报告中采用的乳腺上皮细胞（MEC）和支气管上皮细胞（NHBE）对腺病毒感染和繁殖比较理想，事实上，尽管它们的有效性还仅限于这些研究，但CRAd对正常细胞的作用，特别是对那些上皮起源、在靶向特殊肿瘤时能被感染的细胞的作用，应该被分析出来。
在腺病毒增殖的很多水平上都可以进行调节，以便产生出CRAd，近几年内实现了2大战略。第一个战略，肿瘤细胞中不必要的病毒基因，如通过结合p53或Rb而负责激活细胞周期的基因，可以被完全或部分敲除。第二个战略，用肿瘤特异的启动子（tsp）替代原有的病毒启动子，来控制病毒基因的转录。在细胞内交换、病毒基因组的核输入、RNA拼接、RNA的核输出、或蛋白翻译等水平上有缺陷的病毒突变体，从概念上说都是CRAd的候选者。例如，对病毒基因的拼接或终止信号的干涉来进行调节，就象肿瘤相关的CD44拼接体，从而使病毒具有肿瘤选择性。但是，事实上我们已经知道，使病毒获得肿瘤特异性增殖特性并没有那么简单。Onyx 的McCormick研究小组提出，E1b-55kDa缺失的腺病毒可在p53缺陷的细胞中选择性增殖，而p53缺陷是肿瘤中一种非常普遍的变异。E1B55K基因编码的蛋白结合并灭活正常细胞中的p53，以便发动病毒增殖，因此只有缺失p53的细胞才允许CRAd增殖，因为不需要病毒E1b-55kDa蛋白来关闭p53，当与少数细胞系进行试验比较时，结果亦如此。
在p53-细胞系C33A和U373中突变病毒株dl1520（Onyx-015）显示出与野生型病毒Ad5wt相似水平的溶细胞能力，但对p53+细胞系U87的溶细胞能力降低了100倍，在相配对的细胞系U20S55K/U2OS和RKOp53/RKO中观察到同样的结果。然而，同样一组溶细胞试验却显示除例外，dl1520在p53+细胞系如HepG2、HiaC和HCT116等细胞中则缺乏增殖能力。在测定子代病毒的滴度时，Rothmann及其同事还报道了p53的状态与dl1520增殖之间缺少相关性。与溶细胞试验的结论相反，U373（p53-）细胞产生dl1520的水平比野生型腺病毒低100倍，U87（p53+）细胞产生dl1520的数量与产生野生型腺病毒的数量相同。在这个报告中，采用一个相应的p53-报告质粒，以具有转录活性的p53的数量，来去除p53+细胞系因MDM2过度表达等机制使p53失活的可能性。此外，当每个细胞被较多的病毒颗粒感染时，在p53-细胞和正常原始细胞中子代病毒产生的差异减小了，可以肯定E1b在高重复感染度的情况下变得不必要了。
Hay及其同事研究了dl338 E1b-55kDa突变体的病毒DNA增殖、病毒蛋白合成、宿主细胞蛋白的关闭、细胞病变效应以及子代病毒产生等，发现其与p53的状态无关。除了dl1520子代病毒产生与p53状态之间缺少相关性以外，Goodrum和Ornelles还叙述了S期细胞比G1期细胞对dl1520的细胞杀伤更加敏感，但野生型腺病毒则不然，这些观察结果似乎与E1b-55kDa蛋白的其它功能有关。先前对病毒蛋白的研究指出，E1B55K突变体在p53缺陷细胞中的增殖被削弱，这个缺陷要归因于由E1b-55kDa-E4-34kDa复合物介导的、核RNA输出损害所引起的晚期病毒蛋白的合成率的减少。病毒mRNA翻译的缺陷也说明了dl1520非依赖性p53的损害。
可以想象，S期细胞几乎不依赖于这种复合物来输出或翻译病毒RNA，因此dl1520对分裂细胞有一定的特异性。影响p53结合而不影响其它E1b-55kD功能的突变体，可能会引起预期的依赖于p53缺失的条件性子代病毒产生，然而，这些功能在蛋白序列中却是不易分离的。另一条针对p53缺陷细胞限制性增殖的步骤可能是使E4-34kDa蛋白区域缺失，这个区域同样可灭活p53。还有一方面，腺病毒传播过程中p53的作用还是一个有待解决的问题，如果p53是子代病毒从感染细胞中有效释放所必需的，那么，就需要把与细胞溶解（能弥补p53的缺陷）相关的其它基因组合入为p53-肿瘤设计的CRAd中。
最近，dl1520（Onyx-015）已经用于头颈、胰腺、卵巢、结直肠、肺和口腔癌的Ⅰ、Ⅱ期临床试验。在这些试验中，系统地或局部地给予了高达2×1013的病毒颗粒，但没有得到客观的肿瘤反应，病毒效力似乎是主要限制，而非毒性。与化疗联合，或在病毒中插入治疗基因，提高了动物模型试验的效果，在CRAd中插入胸腺嘧啶核苷激酶基因，显示出CRAd被赋予了治疗功效和安全特性。然而，放疗、化疗、病毒增殖的细胞毒性基因治疗、以及定时安排这些辅助的肿瘤溶解性治疗，这些方案的效果还没有被评估出来，但在尝试进行复杂的联合应用之前，对单一制剂的缺点的了解应该是令人满意的。
为特异增殖设计的病毒突变体，其Rb结合位点E1a缺失，这些突变体不能诱导静止期细胞通过G2/M限速点而进入有丝分裂。Ad△24是这些突变体的其中之一，它被用来研究对胶质母细胞瘤的溶瘤作用，预先被表达Rb的腺病毒载体感染而静止的细胞，变得对Ad△24的溶细胞作用具有抗拒力。在脑肿瘤中，当周围正常细胞处于静止状态时，Ad△24的特异性足以使其在分裂肿瘤细胞中达到一定的增殖水平。无Rb和p300结合能力的突变体很有可能更具肿瘤选择性，因为它们不能够诱导细胞至S期。现在还缺少允许腺病毒在正常细胞内增殖的好的动物模型，这是评价Ad△24和其它CRAd毒性的一个障碍。
获得肿瘤选择性增殖的第二种策略，是采用肿瘤或组织特异性启动子取代病毒启动子。Paul Hallenbeck和Daniel R. Henderson在这方面作出了领先研究，他们用α-甲胎蛋白（AFP）和前列腺特异抗原（PSA）启动子驱动腺病毒E1a基因，分别治疗肝细胞癌和前列腺癌，尽管用这些启动子显示出一定程度的特异性，但人们也知道了细胞启动子在病毒基因组中不能保持正确的精确度。低水平的病毒产物如E1a，可能足以保证病毒增殖，因而妨碍了其特异性，有几种机制可以引起启动子的失真：病毒基因组中增强子的存在，病毒DNA结合蛋白的存在并代替组蛋白，转录活性中心病毒基因组的定位，以及其它一些因素。启动子与基因组DNA序列的隔绝显示可以增加启动子的保真度。
在另一个不同的策略中，通过传递质粒中的调控病毒基因表达盒，避免cis序列的干扰，使病毒增殖仅限于一个循环。需要大量产物的病毒基因的调控，以及参与一项病毒功能（如RNA转移过程中的E1b-55kDa和E4-34kDa的作用）的几种病毒基因的调控，能够进一步限制病毒的增殖。基于这方面的考虑，人们报道了一个有两种不同的前列腺特异启动子进行双重调控的E1a/E1b腺病毒，它在非前列腺肿瘤细胞中非常稀少。如果病毒中启动子的保真度能得以改进，启动子的调控前景还是诱人的，因为它不过分依赖于我们对病毒功能的了解。此外，这个策略比起E1a有它的优越性，即E1a在正常细胞中表达的缺失可能会降低与E1a相关的毒性。
在上述策略中，CRAd所能容纳的外源DNA的大小是有限的，当病毒增殖不需要早期E3区时，适当的细胞溶解和部分逃避免疫系统实际上是必需的，因此，一个完整无缺的CRAd仅能额外容纳1.8kb的DNA。为避免这种限制，人们应用了一个双重系统，由一种含独立AFP-E1表达盒的36kb容量的腺病毒和一种E1缺失的腺病毒组成，这个系统能选择性溶解AFP表达肿瘤。在一个相似的补充策略中，能够增加肿瘤内表达的治疗效果。然而，对双重感染的需要，减弱了低重复感染度时的效果，其结果类似于系统传递后或在感染效率低的肿瘤中的情况。
二． 传递和肿瘤内传播
虽然非增殖腺病毒载体一直是进行有效的和对肿瘤选择性传递的无数修饰的主要目标，但对增殖性腺病毒的传递还做得很少。尽管如此，用于腺病毒载体传递的规则也是用于CRAd传递。恰当的传递能避免正常细胞的感染使其免造毒性作用，所以它包含了肿瘤靶向性的概念。可是，对局限性或播散性肿瘤的传递要求有很大差异。对局限的恶性肿瘤，增殖性腺病毒的肿瘤靶向性要求并不严格，局限性卵巢癌、头颈癌、脑肿瘤可以采用直接注射的方式获得成功的机会，而对播散性癌症，则必须进行系统传递。
腺病毒不是一个血液生成性病毒，它从血液中清除是非常有效的，象很多其它的病毒、颗粒、胶体一样，腺病毒可以被肝枯否氏细胞通过一种不明的机制快速清除，这种机制似乎不依赖于病毒衣壳纤维与柯萨奇腺病毒受体（CAR）的相似作用。其它的依赖CAR的细胞相互作用，如与肝细胞的作用，可通过脱离CAR结合游离腺病毒而得以回避，采用这种方式，CAR结合的脱离可以减少与腺病毒系统传递有关的肝细胞毒性。还有，基于疏水性和承载力的变化对其它衣壳的改造，其目的是增加病毒在血液中的持续性，进而使病毒容易向肿瘤传递。
内皮细胞屏障的多孔性可以解释一定水平的被动性肿瘤靶向性，因为除脾和肝血管外，只有肿瘤血管可以允许腺病毒大小的颗粒外渗，这就是不为所知的长循环脂质体携带药物进行系统传递的原理。另一方面，通过抗体或其它附着物，如表皮生长因子和碱性纤维母细胞生长因子，与病毒衣壳连接，获得主动的肿瘤靶向性，这些复合物在体内的稳定性及大小需要进一步投入研究。一个比较好的策略是对病毒纤维或其它暴露的衣壳蛋白进行遗传学上的改造，使其形成肿瘤特异的附着物，在这方面取得的进展，受到了腺病毒纤维中成功插入Arg-Gly-Asp（RGD）表型的短肽的鼓舞，结果是使腺病毒重新定靶。
最后，增殖性载体基因组的非病毒传递是避免血液清除、靶向作用和关系到腺病毒颗粒的毒性限制的另外一个方式。因此，线性腺病毒DNA感染力低，特别是在DNA纯化后末端蛋白仍保持与起增殖引物作用的末端连接的时候。循环中的腺病毒基因组结合在末端结构的感染性质粒上，如果这些质粒的感染性能够通过修改末端重复序列而得以提高，那么它们就能够有效地停留在增殖的起始复合物上，这些质粒就能通过系统调控和肿瘤靶向的非病毒载体进行传递。
肿瘤内传播是不同于传递的一个问题，如上所述，选择性肿瘤传递需要解除腺病毒的自然趋向性，这种趋向性由其结合CAR决定。相反，提高肿瘤内传播，是希望多种进入途径扩大趋向性，避免非感染性肿瘤细胞的选择。另一个不同点是，在病毒与附着物连接完成传递过程的时候，肿瘤内传播需要衣壳的遗传学改造，使其在子代病毒中仍然保持下去。5型腺病毒受体的自然功能尚未被了解，但它的表达似乎无所不在，然而，有一些报告指出，在一些情况下，肿瘤的CAR水平很低。要扩大病毒的趋向性，就要使附着物合并入病毒纤维中，而不影响CAR的结合，腺病毒纤维的HI环和C末端允许上述插入，一些短肽的插入，如结合硫酸肝素和多价阴离子细胞受体的线性赖氨酸，以及含有RGD表型与αν整合素结合的肽类，显示能扩大病毒趋向性，增加感染性。在CRAd病毒纤维C末端插入多聚赖氨酸，通过在胶质母细胞瘤细胞系U373MG肿瘤内调控，使体内体外Onyx-015的溶瘤潜力提高。可是，就象已经描述过的几种病毒一样，所选择的在体内增强或大范围结合的病毒株或突变株，在系统调控后可能不能靶向特异类型的细胞。
增加病毒传播的另一种方法，是增强增殖性载体从肿瘤细胞中释放。缺失了E1b-19kDa抗凋亡病毒基因的增殖腺病毒能诱导明显的细胞凋亡，其释放较早，传播也比野生型快，E1b-55kDa和E1b-19kDa的联合缺失，能增强E1b-55kDa突变体如Onyx-015的溶瘤效果，E1b完全缺失的腺病毒具有细胞毒性作用，然而，E1b-19kDa缺失对子代病毒产生的影响，在不同细胞系中是不定的，过早的细胞凋亡对子代病毒产生的影响还是一个问题。此外，还应该考虑到随后的毒性作用对正常细胞凋亡的可能的诱导反应，排除细胞死亡的E1b-19kDa等病毒抑制因子的缺失，人们寻找腺病毒促进细胞死亡的增强机制。保留CRAd腺病毒E3-11.6kDa死亡蛋白，显示能增强颗粒释放和溶瘤潜能，L3-23kDa对角蛋白的溶解作用，和L4-100kDa对细胞转化的抑制作用，也能够促进细胞溶解和子代病毒释放。CRAd的溶瘤潜能不依赖于这些病毒的功能，这方面还有待研究。
另一个需要探索研究的领域是CRAd在整个肿瘤内扩散，几种血管活性药物、细胞因子、物理治疗如放疗或热疗，都能增加肿瘤血管的通透性和血流量，引起病毒的快速扩散，与CRAd合用溶细胞酶如透明质酸酶，也能够增加扩散效率。
三． 免疫反应的控制
如早前提到的，成功的病毒治疗的最大障碍就是中和免疫反应。早前的野生型腺病毒的临床实验，在有活性的血清中和抗体的患者中很少观察到治疗反应。给予可的松可减轻免疫反应，尽管它似乎能够增强初始时的肿瘤内部坏死，但它没有影响抗体的产生。在Onyx-015的实验中，当应用一个高度纯化的病毒时，看上去至少先前存在的抗体水平 不影响抗肿瘤活性或毒性，虽然溶瘤作用与免疫反应动力学在临床实验中应慎重研究，了解CRAd的限制性，但发展一个合适的临床前模型还是一个需要改进的研究领域。
免疫系统与增殖腺病毒的相互作用的临床前研究，因为缺少合适的动物模型而受到限制，因为在其它种类包括猴子的动物中，人类腺病毒的增殖能力很低，因为这个原因，只能应用免疫缺陷的鼠科动物模型，来研究异种移植的人类肿瘤的溶瘤潜能。或许对病毒治疗中的免疫系统影响的临床前研究，仅是借助于病毒能够增殖的啮齿动物中疱疹病毒hrR3的溶瘤模型。在一份报告中，内在的免疫前IgM和中和抗体，能阻碍鼠脑肿瘤溶瘤的成功，相反，在免疫活性或免疫缺陷的小鼠身上用hrR3治疗肿瘤肝转移，没有发现有差异。
经口鼻给不同种类动物予以Ad5，再现人类感染的病理过程。Cotton鼠和猪被确认为是最合适Ad5增殖的模型，Ad5增殖一定程度上主要发生于肺组织。虽然在这些免疫活性宿主身上进行的溶瘤病毒的效力方面取得了一些结论，但就象Ad5在组织中的滴度和输出剂量之间的相关性所指出的那样，这些模型不足以进行腺病毒的毒性实验。在真正被许可的动物中，组织中病毒的滴度不依赖于注射的剂量，一般说来，小鼠和猴的细胞允许Ad5 DNA增殖，但晚期封闭作用阻碍了子代病毒的产生。然而，有一些证据显示小鼠支持Ad5低水平的增殖，在给予小鼠和大鼠高剂量的静脉注射后，Ad5虽经历失败，但在很多肝细胞中感染及发挥溶细胞作用，并且少数能在低水平上完成病毒繁殖。Khoobyarian及其同事观察到，Ad2子代病毒在大鼠黑色素瘤细胞中产生，他们应用这个模型进行溶瘤实验，只有在肿瘤皮下种植后不久给予高剂量Ad2注射才有效果，大鼠细胞对Ad2的低许可性能解释这种有效性的缺乏。
在尝试为CRAd寻找一种好的小鼠模型时，Ganly及其同事最近研究了Ad2在小鼠细胞中的增殖，B9和SN161两种细胞系显示产生子代病毒的能力分别比人A2780Cp细胞系低50和25倍，但没有同普遍应用的人293细胞系相比较。这个工作可能导向免疫活性动物模型，以此获得一些病毒治疗的可能，提供研究并减少免疫系统反应的可能性。可以想象，中和抗体将抵消病毒的传播，抗病毒的细胞毒T淋巴细胞也将消灭感染的细胞，这种情况下，使免疫反应朝向T辅助细胞I型转移，能改变溶瘤的结果。IL-12能引起免疫反应的转移，并显示能取消针对腺病毒载体的中和抗体的产生。
四． 结论
为了治疗局限性和播散性癌症，构建了具有选择性靶向特性和扩增能力的增殖性腺病毒。当化疗和免疫治疗还是目前播散性肿瘤治疗的主要选择时，能够系统传播并靶向肿瘤细胞的一种病毒制剂，能以肿瘤特异的一种方式增强其细胞溶解效应，这无疑对临床十分有益。这种制剂具有免疫系统的一些特性，其优点是在给予制剂时肿瘤没有暴露给免疫系统，因此病毒制剂没有选择逃避免疫系统的特异性机制。血肿的持续性、肿瘤靶向性、肿瘤特异增殖、周围传播以及与免疫系统的相互作用，都是病毒制剂得以确认应用的障碍，在这些领域，正在进行中的每一项研究，都可改善其功效与毒性比，尽管如何调控病毒增殖以及如何利用它，还有很多需要去认识，提出选择性魔术导弹的主张是时候了。
（有关基因治疗载体的一些知识，以及增殖病毒的内容，在新基因网（www.sino-gene.cn)有很多介绍，也许对有些人有用。
癌症治疗中的增殖性腺病毒
Alemany R, Balague C, Curiel DT
（Replicative adenoviruses for cancer therapy.
Nat Biotechnol. 2000 Jul;18(7):723-7. Review. ）
摘要： 在癌症治疗领域取得的快速进展就是具有增殖活性的病毒。腺病毒是一种温和的致病性人类病毒，它可在多数人类癌症的起源细胞——上皮细胞中大量繁殖。当病毒学家掌握了有关其与细胞之间分子相互作用的很多细节之时，那些应用型科学家已经发展起来强有力的技术，来对每一个病毒蛋白进行遗传学上的改造和调节。紧接着，在癌症基因治疗方面取得的非增殖性腺病毒载体的有限的成就，使腺病毒溶瘤作用的古老概念重新引起世人注目。大多数的努力主要集中于，使肿瘤细胞中非必须的病毒功能缺失，或者以肿瘤特异性启动子调节病毒基因，从而获得病毒的选择性增殖。然而，人们所预计的病毒增殖选择性却没有实现，原因是对于复杂的病毒与细胞间的相互作用还不甚完全了解，以及病毒基因组中细胞启动子的遗失。对于病毒衣壳所进行的改造，使病毒的肿瘤靶向性得以实现，并且增强了其感染性。具有较大溶瘤潜能的细胞功能和病毒功能也得到了阐明。最后，病毒与机体免疫系统的相互影响，很可能预示着这种途径作为癌症治疗方法的成功。
病毒治疗的概念，即以病毒治疗癌症的方法，是受本世纪早期的一个偶然发现的启发而产生的，这就是感染了病毒或接受了疫苗接种的癌症患者所发生的肿瘤消退。随后很多不同类型的病毒作为肿瘤细胞的溶解剂进行了临床试验，但其较低的功效与毒性比使之被放弃。腺病毒在1953年被提纯后不久，因为其在人类上皮细胞系中呈增殖性生长，即被作为一种溶瘤制剂进行了试验。在早期的试验中，30例宫颈癌患者被注射了不同血清型的腺病毒，结果与其它病毒的试验相一致，即先发生肿瘤消退，紧接着出现肿瘤生长，相反地却伴有与抗病毒有关的免疫反应，缺少明显的治疗功效，使研究者们放弃了把腺病毒作为抗肿瘤制剂的尝试。
尽管如此，几种类型病毒作为有希望的抗肿瘤制剂，最近重又被提起。关于病毒与细胞相互作用的加深了解，主要集中于一些病毒对肿瘤细胞的自然趋向性。例如，呼肠病毒需要激活ras途径进行感染，而微小自主病毒的生活周期被限定在活跃增殖的细胞中。同样，单纯疱疹病毒Ⅰ型的几种自然或构建的突变体仅能在分裂细胞中增殖。基于对腺病毒与细胞周期调节蛋白的相互作用的加深了解，以及把腺病毒作为基因传递媒介来应用所得到的经验，腺病毒也是作为能被改造成具有亲瘤特性的病毒而出现的。尽管腺病毒的肿瘤选择性可在不同水平上得以解决，但是，集中了大多数努力的研究领域可能是发展有条件的增殖性腺病毒（CRAds），将其设计为仅限在肿瘤细胞内增殖。改善CRAds针对局部的和播散性疾病的传递，以及病毒在肿瘤内的传播，是正在成长中的研究领域。最后，相当重要的一点，对增殖性腺病毒与免疫系统相互作用的研究是必不可少的，目的是改善病毒溶瘤作用的效果。在此，我们综述了在这些不同水平上对增殖性腺病毒所进行的研究，为今后的研究提供一些见解。
一． 腺病毒的肿瘤选择性增殖
因为有了Onyx制药公司（Richmond CA）的领先努力，对于选择性在肿瘤细胞内增殖的腺病毒的研究和设计，成为以腺病毒为基础的癌症病毒治疗的最为集中的研究领域。在分析有关病毒选择性增殖的研究能得到些什么之前，先评论一下试验所采用的测定方法是有用的。
通过在体外比较不同得人类细胞系，CRAd选择性增殖被广泛地研究。不同的细胞系显示出对腺病毒感染和病毒繁殖的易感性水平有不同，但这些变量常常被忽视，这个缺点可以通过与非选择性腺病毒如野生型腺病毒（Adwt）的比较而得以纠正，虽然不是所有研究都兼顾了这个对照试验。体外CRAd的作用，在病毒DNA增殖、晚期基因表达、细胞死亡以及子代病毒产生水平上进行了测定，这些参数经常毫无关联。病毒DNA增殖、外壳六联体表达和细胞死亡在没有子代病毒产生时也可以发生。相反，在一些类型细胞中，如纤维母细胞和角质细胞，病毒的产生可以不伴有明显的细胞病变效应。因此，尽管结晶紫染色法、台盼蓝排除法以及其它存活与死亡细胞鉴别检测方法都让位于CRAd在每一类型细胞中的效应信息，但从溶瘤的观点出发，子代病毒的产生是最有意义的。此外，与通过反复冻融使病毒从细胞释放出来后在测定相比，释放到上清中的子代病毒预计可能具有更高的溶瘤价值。对于某一特定类型的细胞，每个细胞产生的病毒感染颗粒的释放数量即是子代病毒产生的定量测定方法。
也许以数学的概念表示CRAd在肿瘤细胞系与正常细胞系之间的选择性的最好最简单的方法是下面这个公式：
CRAd在肿瘤细胞中的释放数量 × Adwt在正常细胞中的释放数量
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CRAd在正常细胞中的释放数量 Adwt在肿瘤细胞中的释放数量
用这个公式计算，假如CRAd在肿瘤细胞中产生1000pfu/细胞，在正常细胞产生1 pfu/细胞，而Adwt则分别产生10000和100 pfu/细胞，那么这个CRAd的肿瘤选择性就是Adwt的10倍。公式中Adwt的出现矫正了不同类型细胞之间病毒感染性和病毒繁殖方面的差异。另一方面，选择正常细胞也是必不可少的。人原始胚胎肾细胞是对腺病毒2型和5型感染最敏感的，在很多不同试验中应用的人纤维母细胞系和内皮细胞系，则显示出很低的感染性以及延迟的细胞病变效应。在一些其它报告中采用的乳腺上皮细胞（MEC）和支气管上皮细胞（NHBE）对腺病毒感染和繁殖比较理想，事实上，尽管它们的有效性还仅限于这些研究，但CRAd对正常细胞的作用，特别是对那些上皮起源、在靶向特殊肿瘤时能被感染的细胞的作用，应该被分析出来。
在腺病毒增殖的很多水平上都可以进行调节，以便产生出CRAd，近几年内实现了2大战略。第一个战略，肿瘤细胞中不必要的病毒基因，如通过结合p53或Rb而负责激活细胞周期的基因，可以被完全或部分敲除。第二个战略，用肿瘤特异的启动子（tsp）替代原有的病毒启动子，来控制病毒基因的转录。在细胞内交换、病毒基因组的核输入、RNA拼接、RNA的核输出、或蛋白翻译等水平上有缺陷的病毒突变体，从概念上说都是CRAd的候选者。例如，对病毒基因的拼接或终止信号的干涉来进行调节，就象肿瘤相关的CD44拼接体，从而使病毒具有肿瘤选择性。但是，事实上我们已经知道，使病毒获得肿瘤特异性增殖特性并没有那么简单。Onyx 的McCormick研究小组提出，E1b-55kDa缺失的腺病毒可在p53缺陷的细胞中选择性增殖，而p53缺陷是肿瘤中一种非常普遍的变异。E1B55K基因编码的蛋白结合并灭活正常细胞中的p53，以便发动病毒增殖，因此只有缺失p53的细胞才允许CRAd增殖，因为不需要病毒E1b-55kDa蛋白来关闭p53，当与少数细胞系进行试验比较时，结果亦如此。
在p53-细胞系C33A和U373中突变病毒株dl1520（Onyx-015）显示出与野生型病毒Ad5wt相似水平的溶细胞能力，但对p53+细胞系U87的溶细胞能力降低了100倍，在相配对的细胞系U20S55K/U2OS和RKOp53/RKO中观察到同样的结果。然而，同样一组溶细胞试验却显示除例外，dl1520在p53+细胞系如HepG2、HiaC和HCT116等细胞中则缺乏增殖能力。在测定子代病毒的滴度时，Rothmann及其同事还报道了p53的状态与dl1520增殖之间缺少相关性。与溶细胞试验的结论相反，U373（p53-）细胞产生dl1520的水平比野生型腺病毒低100倍，U87（p53+）细胞产生dl1520的数量与产生野生型腺病毒的数量相同。在这个报告中，采用一个相应的p53-报告质粒，以具有转录活性的p53的数量，来去除p53+细胞系因MDM2过度表达等机制使p53失活的可能性。此外，当每个细胞被较多的病毒颗粒感染时，在p53-细胞和正常原始细胞中子代病毒产生的差异减小了，可以肯定E1b在高重复感染度的情况下变得不必要了。
Hay及其同事研究了dl338 E1b-55kDa突变体的病毒DNA增殖、病毒蛋白合成、宿主细胞蛋白的关闭、细胞病变效应以及子代病毒产生等，发现其与p53的状态无关。除了dl1520子代病毒产生与p53状态之间缺少相关性以外，Goodrum和Ornelles还叙述了S期细胞比G1期细胞对dl1520的细胞杀伤更加敏感，但野生型腺病毒则不然，这些观察结果似乎与E1b-55kDa蛋白的其它功能有关。先前对病毒蛋白的研究指出，E1B55K突变体在p53缺陷细胞中的增殖被削弱，这个缺陷要归因于由E1b-55kDa-E4-34kDa复合物介导的、核RNA输出损害所引起的晚期病毒蛋白的合成率的减少。病毒mRNA翻译的缺陷也说明了dl1520非依赖性p53的损害。
可以想象，S期细胞几乎不依赖于这种复合物来输出或翻译病毒RNA，因此dl1520对分裂细胞有一定的特异性。影响p53结合而不影响其它E1b-55kD功能的突变体，可能会引起预期的依赖于p53缺失的条件性子代病毒产生，然而，这些功能在蛋白序列中却是不易分离的。另一条针对p53缺陷细胞限制性增殖的步骤可能是使E4-34kDa蛋白区域缺失，这个区域同样可灭活p53。还有一方面，腺病毒传播过程中p53的作用还是一个有待解决的问题，如果p53是子代病毒从感染细胞中有效释放所必需的，那么，就需要把与细胞溶解（能弥补p53的缺陷）相关的其它基因组合入为p53-肿瘤设计的CRAd中。
最近，dl1520（Onyx-015）已经用于头颈、胰腺、卵巢、结直肠、肺和口腔癌的Ⅰ、Ⅱ期临床试验。在这些试验中，系统地或局部地给予了高达2×1013的病毒颗粒，但没有得到客观的肿瘤反应，病毒效力似乎是主要限制，而非毒性。与化疗联合，或在病毒中插入治疗基因，提高了动物模型试验的效果，在CRAd中插入胸腺嘧啶核苷激酶基因，显示出CRAd被赋予了治疗功效和安全特性。然而，放疗、化疗、病毒增殖的细胞毒性基因治疗、以及定时安排这些辅助的肿瘤溶解性治疗，这些方案的效果还没有被评估出来，但在尝试进行复杂的联合应用之前，对单一制剂的缺点的了解应该是令人满意的。
为特异增殖设计的病毒突变体，其Rb结合位点E1a缺失，这些突变体不能诱导静止期细胞通过G2/M限速点而进入有丝分裂。Ad△24是这些突变体的其中之一，它被用来研究对胶质母细胞瘤的溶瘤作用，预先被表达Rb的腺病毒载体感染而静止的细胞，变得对Ad△24的溶细胞作用具有抗拒力。在脑肿瘤中，当周围正常细胞处于静止状态时，Ad△24的特异性足以使其在分裂肿瘤细胞中达到一定的增殖水平。无Rb和p300结合能力的突变体很有可能更具肿瘤选择性，因为它们不能够诱导细胞至S期。现在还缺少允许腺病毒在正常细胞内增殖的好的动物模型，这是评价Ad△24和其它CRAd毒性的一个障碍。
获得肿瘤选择性增殖的第二种策略，是采用肿瘤或组织特异性启动子取代病毒启动子。Paul Hallenbeck和Daniel R. Henderson在这方面作出了领先研究，他们用α-甲胎蛋白（AFP）和前列腺特异抗原（PSA）启动子驱动腺病毒E1a基因，分别治疗肝细胞癌和前列腺癌，尽管用这些启动子显示出一定程度的特异性，但人们也知道了细胞启动子在病毒基因组中不能保持正确的精确度。低水平的病毒产物如E1a，可能足以保证病毒增殖，因而妨碍了其特异性，有几种机制可以引起启动子的失真：病毒基因组中增强子的存在，病毒DNA结合蛋白的存在并代替组蛋白，转录活性中心病毒基因组的定位，以及其它一些因素。启动子与基因组DNA序列的隔绝显示可以增加启动子的保真度。
在另一个不同的策略中，通过传递质粒中的调控病毒基因表达盒，避免cis序列的干扰，使病毒增殖仅限于一个循环。需要大量产物的病毒基因的调控，以及参与一项病毒功能（如RNA转移过程中的E1b-55kDa和E4-34kDa的作用）的几种病毒基因的调控，能够进一步限制病毒的增殖。基于这方面的考虑，人们报道了一个有两种不同的前列腺特异启动子进行双重调控的E1a/E1b腺病毒，它在非前列腺肿瘤细胞中非常稀少。如果病毒中启动子的保真度能得以改进，启动子的调控前景还是诱人的，因为它不过分依赖于我们对病毒功能的了解。此外，这个策略比起E1a有它的优越性，即E1a在正常细胞中表达的缺失可能会降低与E1a相关的毒性。
在上述策略中，CRAd所能容纳的外源DNA的大小是有限的，当病毒增殖不需要早期E3区时，适当的细胞溶解和部分逃避免疫系统实际上是必需的，因此，一个完整无缺的CRAd仅能额外容纳1.8kb的DNA。为避免这种限制，人们应用了一个双重系统，由一种含独立AFP-E1表达盒的36kb容量的腺病毒和一种E1缺失的腺病毒组成，这个系统能选择性溶解AFP表达肿瘤。在一个相似的补充策略中，能够增加肿瘤内表达的治疗效果。然而，对双重感染的需要，减弱了低重复感染度时的效果，其结果类似于系统传递后或在感染效率低的肿瘤中的情况。
二． 传递和肿瘤内传播
虽然非增殖腺病毒载体一直是进行有效的和对肿瘤选择性传递的无数修饰的主要目标，但对增殖性腺病毒的传递还做得很少。尽管如此，用于腺病毒载体传递的规则也是用于CRAd传递。恰当的传递能避免正常细胞的感染使其免造毒性作用，所以它包含了肿瘤靶向性的概念。可是，对局限性或播散性肿瘤的传递要求有很大差异。对局限的恶性肿瘤，增殖性腺病毒的肿瘤靶向性要求并不严格，局限性卵巢癌、头颈癌、脑肿瘤可以采用直接注射的方式获得成功的机会，而对播散性癌症，则必须进行系统传递。
腺病毒不是一个血液生成性病毒，它从血液中清除是非常有效的，象很多其它的病毒、颗粒、胶体一样，腺病毒可以被肝枯否氏细胞通过一种不明的机制快速清除，这种机制似乎不依赖于病毒衣壳纤维与柯萨奇腺病毒受体（CAR）的相似作用。其它的依赖CAR的细胞相互作用，如与肝细胞的作用，可通过脱离CAR结合游离腺病毒而得以回避，采用这种方式，CAR结合的脱离可以减少与腺病毒系统传递有关的肝细胞毒性。还有，基于疏水性和承载力的变化对其它衣壳的改造，其目的是增加病毒在血液中的持续性，进而使病毒容易向肿瘤传递。
内皮细胞屏障的多孔性可以解释一定水平的被动性肿瘤靶向性，因为除脾和肝血管外，只有肿瘤血管可以允许腺病毒大小的颗粒外渗，这就是不为所知的长循环脂质体携带药物进行系统传递的原理。另一方面，通过抗体或其它附着物，如表皮生长因子和碱性纤维母细胞生长因子，与病毒衣壳连接，获得主动的肿瘤靶向性，这些复合物在体内的稳定性及大小需要进一步投入研究。一个比较好的策略是对病毒纤维或其它暴露的衣壳蛋白进行遗传学上的改造，使其形成肿瘤特异的附着物，在这方面取得的进展，受到了腺病毒纤维中成功插入Arg-Gly-Asp（RGD）表型的短肽的鼓舞，结果是使腺病毒重新定靶。
最后，增殖性载体基因组的非病毒传递是避免血液清除、靶向作用和关系到腺病毒颗粒的毒性限制的另外一个方式。因此，线性腺病毒DNA感染力低，特别是在DNA纯化后末端蛋白仍保持与起增殖引物作用的末端连接的时候。循环中的腺病毒基因组结合在末端结构的感染性质粒上，如果这些质粒的感染性能够通过修改末端重复序列而得以提高，那么它们就能够有效地停留在增殖的起始复合物上，这些质粒就能通过系统调控和肿瘤靶向的非病毒载体进行传递。
肿瘤内传播是不同于传递的一个问题，如上所述，选择性肿瘤传递需要解除腺病毒的自然趋向性，这种趋向性由其结合CAR决定。相反，提高肿瘤内传播，是希望多种进入途径扩大趋向性，避免非感染性肿瘤细胞的选择。另一个不同点是，在病毒与附着物连接完成传递过程的时候，肿瘤内传播需要衣壳的遗传学改造，使其在子代病毒中仍然保持下去。5型腺病毒受体的自然功能尚未被了解，但它的表达似乎无所不在，然而，有一些报告指出，在一些情况下，肿瘤的CAR水平很低。要扩大病毒的趋向性，就要使附着物合并入病毒纤维中，而不影响CAR的结合，腺病毒纤维的HI环和C末端允许上述插入，一些短肽的插入，如结合硫酸肝素和多价阴离子细胞受体的线性赖氨酸，以及含有RGD表型与αν整合素结合的肽类，显示能扩大病毒趋向性，增加感染性。在CRAd病毒纤维C末端插入多聚赖氨酸，通过在胶质母细胞瘤细胞系U373MG肿瘤内调控，使体内体外Onyx-015的溶瘤潜力提高。可是，就象已经描述过的几种病毒一样，所选择的在体内增强或大范围结合的病毒株或突变株，在系统调控后可能不能靶向特异类型的细胞。
增加病毒传播的另一种方法，是增强增殖性载体从肿瘤细胞中释放。缺失了E1b-19kDa抗凋亡病毒基因的增殖腺病毒能诱导明显的细胞凋亡，其释放较早，传播也比野生型快，E1b-55kDa和E1b-19kDa的联合缺失，能增强E1b-55kDa突变体如Onyx-015的溶瘤效果，E1b完全缺失的腺病毒具有细胞毒性作用，然而，E1b-19kDa缺失对子代病毒产生的影响，在不同细胞系中是不定的，过早的细胞凋亡对子代病毒产生的影响还是一个问题。此外，还应该考虑到随后的毒性作用对正常细胞凋亡的可能的诱导反应，排除细胞死亡的E1b-19kDa等病毒抑制因子的缺失，人们寻找腺病毒促进细胞死亡的增强机制。保留CRAd腺病毒E3-11.6kDa死亡蛋白，显示能增强颗粒释放和溶瘤潜能，L3-23kDa对角蛋白的溶解作用，和L4-100kDa对细胞转化的抑制作用，也能够促进细胞溶解和子代病毒释放。CRAd的溶瘤潜能不依赖于这些病毒的功能，这方面还有待研究。
另一个需要探索研究的领域是CRAd在整个肿瘤内扩散，几种血管活性药物、细胞因子、物理治疗如放疗或热疗，都能增加肿瘤血管的通透性和血流量，引起病毒的快速扩散，与CRAd合用溶细胞酶如透明质酸酶，也能够增加扩散效率。
三． 免疫反应的控制
如早前提到的，成功的病毒治疗的最大障碍就是中和免疫反应。早前的野生型腺病毒的临床实验，在有活性的血清中和抗体的患者中很少观察到治疗反应。给予可的松可减轻免疫反应，尽管它似乎能够增强初始时的肿瘤内部坏死，但它没有影响抗体的产生。在Onyx-015的实验中，当应用一个高度纯化的病毒时，看上去至少先前存在的抗体水平 不影响抗肿瘤活性或毒性，虽然溶瘤作用与免疫反应动力学在临床实验中应慎重研究，了解CRAd的限制性，但发展一个合适的临床前模型还是一个需要改进的研究领域。
免疫系统与增殖腺病毒的相互作用的临床前研究，因为缺少合适的动物模型而受到限制，因为在其它种类包括猴子的动物中，人类腺病毒的增殖能力很低，因为这个原因，只能应用免疫缺陷的鼠科动物模型，来研究异种移植的人类肿瘤的溶瘤潜能。或许对病毒治疗中的免疫系统影响的临床前研究，仅是借助于病毒能够增殖的啮齿动物中疱疹病毒hrR3的溶瘤模型。在一份报告中，内在的免疫前IgM和中和抗体，能阻碍鼠脑肿瘤溶瘤的成功，相反，在免疫活性或免疫缺陷的小鼠身上用hrR3治疗肿瘤肝转移，没有发现有差异。
经口鼻给不同种类动物予以Ad5，再现人类感染的病理过程。Cotton鼠和猪被确认为是最合适Ad5增殖的模型，Ad5增殖一定程度上主要发生于肺组织。虽然在这些免疫活性宿主身上进行的溶瘤病毒的效力方面取得了一些结论，但就象Ad5在组织中的滴度和输出剂量之间的相关性所指出的那样，这些模型不足以进行腺病毒的毒性实验。在真正被许可的动物中，组织中病毒的滴度不依赖于注射的剂量，一般说来，小鼠和猴的细胞允许Ad5 DNA增殖，但晚期封闭作用阻碍了子代病毒的产生。然而，有一些证据显示小鼠支持Ad5低水平的增殖，在给予小鼠和大鼠高剂量的静脉注射后，Ad5虽经历失败，但在很多肝细胞中感染及发挥溶细胞作用，并且少数能在低水平上完成病毒繁殖。Khoobyarian及其同事观察到，Ad2子代病毒在大鼠黑色素瘤细胞中产生，他们应用这个模型进行溶瘤实验，只有在肿瘤皮下种植后不久给予高剂量Ad2注射才有效果，大鼠细胞对Ad2的低许可性能解释这种有效性的缺乏。
在尝试为CRAd寻找一种好的小鼠模型时，Ganly及其同事最近研究了Ad2在小鼠细胞中的增殖，B9和SN161两种细胞系显示产生子代病毒的能力分别比人A2780Cp细胞系低50和25倍，但没有同普遍应用的人293细胞系相比较。这个工作可能导向免疫活性动物模型，以此获得一些病毒治疗的可能，提供研究并减少免疫系统反应的可能性。可以想象，中和抗体将抵消病毒的传播，抗病毒的细胞毒T淋巴细胞也将消灭感染的细胞，这种情况下，使免疫反应朝向T辅助细胞I型转移，能改变溶瘤的结果。IL-12能引起免疫反应的转移，并显示能取消针对腺病毒载体的中和抗体的产生。
四． 结论
为了治疗局限性和播散性癌症，构建了具有选择性靶向特性和扩增能力的增殖性腺病毒。当化疗和免疫治疗还是目前播散性肿瘤治疗的主要选择时，能够系统传播并靶向肿瘤细胞的一种病毒制剂，能以肿瘤特异的一种方式增强其细胞溶解效应，这无疑对临床十分有益。这种制剂具有免疫系统的一些特性，其优点是在给予制剂时肿瘤没有暴露给免疫系统，因此病毒制剂没有选择逃避免疫系统的特异性机制。血肿的持续性、肿瘤靶向性、肿瘤特异增殖、周围传播以及与免疫系统的相互作用，都是病毒制剂得以确认应用的障碍，在这些领域，正在进行中的每一项研究，都可改善其功效与毒性比，尽管如何调控病毒增殖以及如何利用它，还有很多需要去认识，提出选择性魔术导弹的主张是时候了。
（有关基因治疗载体的一些知识，以及增殖病毒的内容，在新基因网（www.sino-gene.cn)有很多介绍，也许对有些人有用。
