发夹型核酶实验

作为有催化活性的 RNA，发夹型核酶在生物体内的作用是位点特异的核酸酶以及 RNA 连接酶。发夹型核酶的催化基序最先是在烟草环斑病毒负链的卫星 RNA 中发现的，它表现一种可逆的自切割反应，最终使滚环复制的产物形成成熟的病毒核酸。发夹型核酶与锤头型核酶都能催化产物的连接，但是发夹型核酶的催化活性要高得多。而且人们发现发夹型核酶催化连接反应的活性比催化切割反应的活性要高近 10 倍，而锤头型核酶正好相反，它催化自我切割的活性比催化连接反应的活性高 100 倍。

终止缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 放射自显影用具 水浴

一、材料与设备

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。

2. 放射自显影用具。

3. 水浴。

4. 终止缓冲液：90% 去离子甲酰胺，0.02% 溴酚蓝，15 mmol/L EDTA，50 mmmol/L HEPES-NaOH (pH 7.5)，0.1 mmol/L EDTA，12 mmol/L MgCl₂。

二、操作方法

1. 发夹型核酶的结构

发夹型核酶剪切与连接活性的基本结构是核酶中区域 A 和 区域 B 的直接相互作用，每个区域主要由进化上保守的内环与两侧的短双链螺旋构成。核酶的基本结构及其切割位点如图。



现在的研究所发现的具有催化活性的发夹型核酶最小的基序为 50 nt，因此可以用固相合成的方法获得发夹型核酶，也可以将修饰的 rNTP 导入核酶以增加其稳定性。

2. 催化反应实验

(1) 反式剪切实验。剪切反应可以从加入特异的阳离子形成底物-核酶复合体开始并从加入变性剂终止反应而结束；也可以通过把底物加入核酶中来启动反应，此时所有 RNA 均先在折叠终离了浓度下预孵育。

典型的剪切反应步骤如下：

① 准备 RNA 溶液。终浓度分別为核酶 0.5 μmol/L、³²P 标记的底物 RNA (1~2 nmol/L)，50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、0.1 mmol/L EDTA。

② 准备阳离子溶液。终浓度分別为 50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、12 mmol/L MgCl₂。

③ 上述两种溶液先在 25℃ 平衡 5 min，再将两溶液各取 40 μl 混合以启动反应。

④ 在 7~12 h 每个时间点取出 3 μl，加入 10 μl 终止缓冲液在冰浴中终止反应。

⑤ 20% PAGE-8 mol/L 尿素胶电泳，放射自显影。

(2) 连接实验。发夹型核酶可以连接带有 5'-OH 和 2'，3'-环化磷酸末端的 RNA。带有 5'-OH 未端的 RNA 可以由化学合成或通过转录产物的去磷酸化得到。而带有 2'，3'-环化磷酸未端的 RNA 仅能通过对发夹型核酶切割的底物跑胶分离后再切胶回收而得到。

连接实验方法与剪切实验方法一致，需要注意的是要保证核酶被剪切产物所饱和。