原理
除锤头型核酶与发夹型核酶以外，还有肝炎 δ 核酶和 Neurospara VS 核酶等小分子核酶。此外，自然界中还存在着大分子核酶，包括 Ⅰ 型内含子、Ⅱ 型内含子和 RNaseP 的 RNA 亚基。
材料与仪器
RNase T1 RNase U2
上样缓冲液 终止缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 放射自显影用具 水浴
上样缓冲液 终止缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 放射自显影用具 水浴
步骤
一、材料与设备
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。
2. 放射自显影用具。
3. 水浴。
4. 上样缓冲液：95% 去离子甲酰胺，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯青。
5. RNase T1、RNase U2 ( Amersham Pharmacia 公司）。
6. 终止缓冲液：95％ 去离子甲酰胺，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯青，10 mmol/L EDTA。
二、操作方法
1. 双分子 δ 核酶系统的设计
(1) 基于肝炎 δ 病毒反义基因组自我剪切基序的反式作用 δ 核酶的结构如图。
(2) 以肝炎 δ 核酶的反义作用机制为基础设计出的双分子 δ 核酶的结构如图所示。
它由两个分子 RzA 与 RzB 组装而成，RzA 分子作为底物结合部分，可以产生反义效应；RzB 分子则是该双分子 δ 核酶的催化活性所必须的部分。该系统之所以在基因治疗中可能有更多潜在的优势就是因为该核酶具有反义与剪切的双重作用。
(3) 双分子 δ 核酶的分子相对较小，可以通过化学合成的方法获得，也可以通过 T7 体外转录的方法获得，此时可将 RzA、RzB 和底物序列的 5' 端设计为 GGC 或 GGG，放在 T7 启动子后，以获得最大的转录效率。
2. RNA 的 T7 体外合成与标记
RNA 的 T7 体外合成方法参照 SELEX；32P 末端标记方法参照锤头型核酶的 32P 末端标记程序。
3. 确定转录产物的 RNA 序列
用消化 RNA-磷酸骨架的核酸酶特异性切割 RNA 以确认转录产物的长度和部分序列。
(1) 反应体系共 4 μl。
(2) 5' 末端标记的 RNA (小于 1 nmol/L，50000 CPM )，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NH4CI，1 U/μl RNase T1 ( 消化单链 RNA 上的 GpN )，1 U/μl RNase U2 ( 消化单链 RNA 上的 ApN )。
(3) 37℃ 孵育 1~5 min。
(4) 加入终止缓冲液 5 μl。
(5) RNA ladder：5 μl 体系含 5' 末端标记的 RNA ( 50000 cpm)、50 mmol/L NaHCO3、 5 mmol/L EDTA，95℃ 放置 5 min。RNA ladder 用来作为分子质量参照。
(6) 根据上述第 (3) 步终止的反应体系与 RNA ladder，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(7) 放射自显影并分析实验结果。
4. 平衡解离常数的测定（可参见 SELEX 第一节的 Kd 部分）
(1) RzA-底物复合物的平衡解离常数的测定。9 μl 反应体系，包括 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1-300 nmol/L RzA，少于 0.1 nmol/L 的末端标记的底物 RNA 在 95℃ 加热 2 min 并迅速置于冰浴中 2 ；37℃ 预平衡 5 min，加入 1 μl 100 mmol/L MgCl2 开始反应；37℃ 孵育 90 min；加入 2 μl 上样缓冲液；非变性 PAGE (12% 聚丙烯酰胺，45 mmol/L Tris-硼酸，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2 ，10% （V/V）甘油）电泳；放射自显影；分析数据可获得 KdRzA。
(2) RzA-RzB 复合物的平衡解离常数的测定同上，0.1~300 nmol/L RzA-小于 0.1 nmol/L 末端标记的 RzB，可以获得 KdRzA；0.1~300 nmol/L RzB 小于 0.1 nmol/L 末端标记的 RzA，可以获得 KdRzB。
(3) KdRzB（RzA' 与 RzB），KdRzA ( RzB' 与 RzA )，KdRzA（S' 与 RzA）分别等于标记 RNA 有一半被结合时未标记的另一条 RNA的浓度。
5. 剪切反应
(1) 平衡解离常数 Kd 的测定结果可以用来估计底物：RzA、RzA-RzB 的比例，但它们的最佳比例仍需通过剪切反应来确定。
(2) 剪切反应体系总体积为 18 μl，包括各种浓度的核酶、小于 1 nmol/L 的底物、 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )；在 95℃ 加热 2 min 并迅速置于冰浴中 2 min；37℃ 预平衡 5 min，加入 2 μl 0.5 mol/L MgCl2 起始剪切反应；37℃ 孵育 3.5 h 或直至剪切完成；取出反应液 2~3 μl，加入 5 μl 终止缓冲液；20% PAGE-8 mol/L 尿素凝胶电泳；放射自显影。
6. 剪切常数 (Kobs) 的测定
未标记的底物 RNA ( <1 nmol/L) 与标记 RNA 混合，终浓度 50 nmol/L，核酶浓度 50~500 nmol/L。
通过根据将剪切实验数据拟合成等式 At =A（1-e-kt） 来确定剪切常数 (Kobs)，公式中的 At 代表在时间点 t 的剪切率， A 代表最大剪切率或剪切最后的时间点，k 即是剪切常数 (Kobs) 。公式中的每个数据均需要至少两次实验来确定，而且每次实验的数据偏差不得大于 15%。
7. 双分子核酶系统对 Mg2+的要求
反应体系：MgCl2 ( 1~500 mmol/L )，RzA，RzB ( RzA : RzB=1 : 3，即分别为 50 与 150 mmol/L)，底物 RNA ( 50 nmol/L)。
计算最大剪切速度一半时的 Mg2+ 浓度。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。
2. 放射自显影用具。
3. 水浴。
4. 上样缓冲液：95% 去离子甲酰胺，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯青。
5. RNase T1、RNase U2 ( Amersham Pharmacia 公司）。
6. 终止缓冲液：95％ 去离子甲酰胺，0.05% 溴酚蓝，0.05% 二甲苯青，10 mmol/L EDTA。
二、操作方法
1. 双分子 δ 核酶系统的设计
(1) 基于肝炎 δ 病毒反义基因组自我剪切基序的反式作用 δ 核酶的结构如图。
(2) 以肝炎 δ 核酶的反义作用机制为基础设计出的双分子 δ 核酶的结构如图所示。
它由两个分子 RzA 与 RzB 组装而成，RzA 分子作为底物结合部分，可以产生反义效应；RzB 分子则是该双分子 δ 核酶的催化活性所必须的部分。该系统之所以在基因治疗中可能有更多潜在的优势就是因为该核酶具有反义与剪切的双重作用。
(3) 双分子 δ 核酶的分子相对较小，可以通过化学合成的方法获得，也可以通过 T7 体外转录的方法获得，此时可将 RzA、RzB 和底物序列的 5' 端设计为 GGC 或 GGG，放在 T7 启动子后，以获得最大的转录效率。
2. RNA 的 T7 体外合成与标记
RNA 的 T7 体外合成方法参照 SELEX；32P 末端标记方法参照锤头型核酶的 32P 末端标记程序。
3. 确定转录产物的 RNA 序列
用消化 RNA-磷酸骨架的核酸酶特异性切割 RNA 以确认转录产物的长度和部分序列。
(1) 反应体系共 4 μl。
(2) 5' 末端标记的 RNA (小于 1 nmol/L，50000 CPM )，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NH4CI，1 U/μl RNase T1 ( 消化单链 RNA 上的 GpN )，1 U/μl RNase U2 ( 消化单链 RNA 上的 ApN )。
(3) 37℃ 孵育 1~5 min。
(4) 加入终止缓冲液 5 μl。
(5) RNA ladder：5 μl 体系含 5' 末端标记的 RNA ( 50000 cpm)、50 mmol/L NaHCO3、 5 mmol/L EDTA，95℃ 放置 5 min。RNA ladder 用来作为分子质量参照。
(6) 根据上述第 (3) 步终止的反应体系与 RNA ladder，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(7) 放射自显影并分析实验结果。
4. 平衡解离常数的测定（可参见 SELEX 第一节的 Kd 部分）
(1) RzA-底物复合物的平衡解离常数的测定。9 μl 反应体系，包括 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1-300 nmol/L RzA，少于 0.1 nmol/L 的末端标记的底物 RNA 在 95℃ 加热 2 min 并迅速置于冰浴中 2 ；37℃ 预平衡 5 min，加入 1 μl 100 mmol/L MgCl2 开始反应；37℃ 孵育 90 min；加入 2 μl 上样缓冲液；非变性 PAGE (12% 聚丙烯酰胺，45 mmol/L Tris-硼酸，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2 ，10% （V/V）甘油）电泳；放射自显影；分析数据可获得 KdRzA。
(2) RzA-RzB 复合物的平衡解离常数的测定同上，0.1~300 nmol/L RzA-小于 0.1 nmol/L 末端标记的 RzB，可以获得 KdRzA；0.1~300 nmol/L RzB 小于 0.1 nmol/L 末端标记的 RzA，可以获得 KdRzB。
(3) KdRzB（RzA' 与 RzB），KdRzA ( RzB' 与 RzA )，KdRzA（S' 与 RzA）分别等于标记 RNA 有一半被结合时未标记的另一条 RNA的浓度。
5. 剪切反应
(1) 平衡解离常数 Kd 的测定结果可以用来估计底物：RzA、RzA-RzB 的比例，但它们的最佳比例仍需通过剪切反应来确定。
(2) 剪切反应体系总体积为 18 μl，包括各种浓度的核酶、小于 1 nmol/L 的底物、 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5 )；在 95℃ 加热 2 min 并迅速置于冰浴中 2 min；37℃ 预平衡 5 min，加入 2 μl 0.5 mol/L MgCl2 起始剪切反应；37℃ 孵育 3.5 h 或直至剪切完成；取出反应液 2~3 μl，加入 5 μl 终止缓冲液；20% PAGE-8 mol/L 尿素凝胶电泳；放射自显影。
6. 剪切常数 (Kobs) 的测定
未标记的底物 RNA ( <1 nmol/L) 与标记 RNA 混合，终浓度 50 nmol/L，核酶浓度 50~500 nmol/L。
通过根据将剪切实验数据拟合成等式 At =A（1-e-kt） 来确定剪切常数 (Kobs)，公式中的 At 代表在时间点 t 的剪切率， A 代表最大剪切率或剪切最后的时间点，k 即是剪切常数 (Kobs) 。公式中的每个数据均需要至少两次实验来确定，而且每次实验的数据偏差不得大于 15%。
7. 双分子核酶系统对 Mg2+的要求
反应体系：MgCl2 ( 1~500 mmol/L )，RzA，RzB ( RzA : RzB=1 : 3，即分别为 50 与 150 mmol/L)，底物 RNA ( 50 nmol/L)。
计算最大剪切速度一半时的 Mg2+ 浓度。
来源：丁香实验
