【原创】脱氧核酶研究进展

笔者正在从事应用脱氧核酶技术进行基因治疗实验研究，搜索论坛里对该技术讨论得不是很多，从目前形势看该技术具有广泛应用前景。于是就自己所了解的东西写出来供大家研究，同时也希望有兴趣者和我交流。

脱氧核酶（deoxyribozyme/DNAzyme）是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。自1994年Breaker首次发现脱氧核酶以来，迄今为止已发现了几十种脱氧核酶，根据其功能可分为7大类，①、具有RNA切割活性，②、具有DNA连接酶活性，③、具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性，④、具有DNA水解活性，⑤、具有DNA激酶活性，⑥、具有N-糖基化酶活性，⑦、具有DNA戴帽活性。其中最特别的是具有RNA切割活性的脱氧核酶，它能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平对基因灭活，从而调控蛋白质的表达，可能成为对抗病毒感染、肿瘤等疾病的新型基因治疗药物和基因功能研究、核酸突变分析等的新型核酸工具酶。
1 具有RNA切割活性的脱氧核酶的结构与特性
Santoro[1]等从包含约1014个随机DNA文库中筛选出两条高效通用的脱氧核酶，10-23型DNAzyme（10-23 DRz）和8-17型DNAzyme（8-17 DRz）（图1，2）。10-23 DRz是第10轮扩增第23过克隆，由15个脱氧核糖核苷酸构成一个环状催化中心，两侧臂各有8个脱氧核糖核苷酸构成酶分子的底物识别部位，其碱基序列与底物通过碱基配对的形式紧密结合。底物识别部位的特殊序列构成提供了特异性底物结合信息，能把DNAzyme的催化性碱基环固定到RNA底物分子上。10-23 DRz的切割位点位于RNA分子上的未配对的嘌呤和配对的嘧啶之间，在接近生理条件下（如2mmol/L MgCl2,150mmol/L KCl, pH7.5, 37℃）切割RNA后可产生2`(3`)-环磷酸和5`-羟基末端的切割产物。8-17 DRz与10-23 DRz的结构十分相似，所不同的是在8-17 DRz中带有不配对的“wobble”成分，即位于切割点相邻处的rG-dT非配对碱基。8-17 DRz要求的切割位点为AG连接，因此在RNA灭活研究中，10-23 DRz更灵活，应用更广。
Feldman[2]等应用体外筛选技术从随机DNA文库中筛选出一种新的脱氧核酶-Biparite DNAzyme，其催化核心区域为22个核苷酸的保守序列，其催化策略类似于丁型肝炎病毒（HDV）核酶，在Mg2＋、Mn2＋存在下，适当的pH和37℃时，具有较强的催化活性。Kong[3]等筛选出一种环状RNA-DNA enzyme，由22-mer核糖核苷酸（RNA）组成的催化区（类似于锤头状核酶）和55-mer的脱氧核糖核苷酸（DNA）片段组成，其中DNA片段含有两个底物识别区（分别为9-mer和6-mer）和一个调节区（40-mer的DNA，含有20个脱氧核糖核苷酸的随机序列），该酶具有很高的稳定性、靶向性和切割活性。随着体外分子进化技术的不断完善，对脱氧核酶的认识不断深入，将有越来越多的脱氧核酶被合成。
脱氧核酶最主要的特性是高效催化性（催化效率Kcat/Km在109mol·L－1·min－1左右），高度专一性（由碱基配对所决定），稳定性，分子量小，价格便宜等。最近研究表明脱氧核酶比核酶具有更高的催化效率和稳定性，且分子量小、容易合成、价格低、切割位点选择的限制更少[4,5]。通过合理设计DNAzyme底物识别部位的核苷酸序列，就能对任何含有嘌呤、嘧啶的RNA分子进行靶向切割，从而调控蛋白质的表达，作为一种新型的RNA水平强效基因灭活因子，脱氧核酶为治疗肿瘤、病毒感染性疾病以及其它相关疾病，基因功能研究，核酸突变分析等提供了一条全新的策略。
2 具有RNA切割活性的脱氧核酶的应用
脱氧核酶将高效的催化降解能力与反义的靶向识别能力结合，使得其应用从基础生物技术领域扩展到医疗领域，在序列特异性RNA降解方面具有广阔的应用前景，在生物体外可以作为RNA的限制性内切酶，在体内可在mRNA水平上关闭基因表达。目前已有一些学者成功地利用脱氧核酶进行细胞内外切割特异性RNA的研究。
2.1 恶性肿瘤的基因治疗
Cairns[6,7]等首先将10-23 DRz用于生物学研究中，使用33-mer的脱氧核酶，两侧分别为9bp的靶特异结合臂，中间为15bp的催化中心，设计了80多条针对HPV16的E6、E7 mRNA的脱氧核酶及60多条针对大鼠c-myc基因的脱氧核酶，应用多重分析方法，发现针对HPV16致瘤基因E6/E7的80种脱氧核酶中有8种脱氧核酶具有很强的切割效率，这种在无细胞体系中筛选出的脱氧核酶在细胞中同样有效。5种针对c-myc的脱氧核酶能显著抑制细胞中c-myc的表达，并抑制平滑肌细胞的增殖。
Wu[8]等设计了针对bcl/abl融合基因（Ph染色体）的脱氧核酶，能特异地切割bcl/abl mRNA，抑制慢性髓性白血病或急性淋巴细胞性白血病细胞的生长，促进癌细胞的凋亡。Sioud[9]等设计了针对恶性肿瘤细胞蛋白激酶Cα (PKCα)异构体的脱氧核酶，该酶能显著抑制细胞中异常的PKCα mRNA的表达，使异常PKCα蛋白减少，减少细胞存活蛋白Bcl-XL的生成，促进多种敏感的恶性肿瘤细胞凋亡，被称为凋亡酶（apoptozymes）。
血管生成（angiogenic）在肿瘤的发生发展中具有重要作用，抗血管生成是目前肿瘤治疗的热点之一。Liu[10]等设计了针对肿瘤血管生成相关的人血小板型12-脂加氧酶（12-LOX）的脱氧核酶，导入红白血病细胞中，能显著抑制12-LOX的表达，有可能成为12-LOX基因敲除的特异性工具和抑制肿瘤生长的新策略。Zhang[11]等设计了一种针对血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的脱氧核酶，该酶能以浓度和时间依赖性的方式有效地切割VEGFR2 mRNA，诱导血管内皮细胞凋亡，显著地抑制血管内皮细胞生长。注入裸鼠移植瘤后能显著抑制肿瘤生长，肿瘤内血管密度明显减少，肿瘤外周区域细胞死亡显著增加，可望成为抗血管生成的又一新型药物。
2.2 其他疾病的基因治疗
目前对AIDS尚缺乏有效的治疗手段，预防HIV的感染具有重要的意义。Zhang[12]等设计了针对HIV-1 HXB2株V3环的脱氧核酶（DzV3-9），该酶在细胞内稳定，明显抑制HIV-1 NL432和SF162株在U87细胞中的复制，且抑制细胞中CD4及共受体的表达,可望用于预防HIV-1的感染。Sriram[13]等设计了针对HIV-1 基因gag的脱氧核酶，在存在时有靶位点特异性切割活性，转入哺乳细胞能抑制gag的表达，抑制HIV-1的感染。Unwalla[14]等设计了针对HIV-1 TAT/Rev基因的脱氧核酶（DNAzyme 5970），能显著抑制HIV-1基因表达，抑制HIV-1的感染。
此外，针对乙型肝炎病毒（HBV）RNA adw2亚型前基因组RNA的同向重复序列1的脱氧核酶，能抑制HBV基因在HeLa细胞内的表达。针对遗传性慢性舞蹈病（Huntington’s disease, HD）mRNA上有效位点的脱氧核酶，能选择性地降解突变的HD mRNA，从而有效地降解HD突变蛋白的表达，缓解HD的发展。针对流感病毒PB2的脱氧核酶能抑制培养细胞中流感病毒的复制。
2.3 基因功能研究
脱氧核酶作为一种mRNA水平的强效基因灭活因子，为基因功能研究提供了新的方法。已有学者通过设计针对未知功能基因的脱氧核酶，从mRNA水平灭活该基因，观察其生物学效应，来进行基因功能研究。
neointima(NI)形成是血管性疾病（如动脉硬化、血管成形术后再狭窄等）的重要特征，但其分子机制还不清楚。Lowe[15]等设计了针对早期生长反应因子（Egr-1）的脱氧核酶来抑制NI形成的鼠模型中Egr-1的表达，结果NI的形成亦受到抑制，表明Egr-1在动脉结扎后动脉内膜增厚中具有重要意义。由于c-Jun在正常动脉壁中很少表达，而在损伤动脉中短暂升高，Khachigian[16]等设计了针对c-Jun的脱氧核酶（Dz13），该酶能抑制血管平滑肌中c-Jun的表达，抑制血管平滑肌细胞的增殖，在体外能阻止损伤的平滑肌细胞的修复，在体内能抑制鼠颈动脉内膜的增厚，表明c-Jun能影响NI的形成，进而在血管性疾病中具有重要的作用。
Twist为一螺旋-环-螺旋的转录因子，参与细胞增殖和凋亡的调节，此外，它还参与颅骨的发育，导致颅缝早闭。Hjiantoniou[17]等设计了针对Twist的脱氧核酶，能切割Twist mRNA，转入C3H10T1/2细胞,可见Twist mRNA水平显著下降，同时P21 mRNA水平显著升高，细胞凋亡增加，表明Twist在凋亡通路中具有重要作用。
2.4 其它应用
Cairn[18]等应用10-23 DRz的序列特异性切割特性，对大量不同基因型的HPV的L1基因的相对保守片段的核酸突变进行分析，发现不同型的HPV特异的DNAzyme能高效地切割其特异的靶底物，而不切割其它序列变异的底物。这种方法可用于组织标本中基因突变的分析，包括SNP分析。Okumoto[19]等将小分子的脱氧核酶固定于层析柱和SPR传感器芯片上，利用其序列特异性切割能力，对RNA二级结构进行鉴别。
Todd[20]等在10-23 DRz的基础上建立了一种新的PCR技术-DzyNA-PCR （脱氧核酶荧光定量PCR）。应用一种特殊的DzyNA引物，在扩增过程中即可产生一种10-23 DRz，能剪切加入扩增体系中的一种RNA和DNA嵌合性报告基因，报告基因5’端结合有荧光基团，第10碱基处结合有淬灭基团，当它被DNAzyme切开后，荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光。随着PCR扩增，DNAzyme不断增加，荧光不断增强，从而对扩增产物的量进行实时监控。
3 存在问题与展望
作为一种新型的治疗药物，与核酶、反义核酸、寡核苷酸等一样，应用脱氧核酶进行基因治疗，最主要的问题是如何提高其在体内的稳定性，如何有效的进入靶细胞，以及其在体内活性的监测及可控性等。
为了提高其在体内的稳定性和靶向性，许多学者尝试对脱氧核酶进行修饰。Unwalla[14] 等利用G-残基能直接与巨噬细胞的清道夫受体相互作用的能力，合成一种脱氧核酶DNAzyme 5970，在3’端含有10个G残基，催化核心区为10-23 DRz的催化区，为了提高其稳定性，在其识别臂分别加上2条12个碱基组成的茎-环结构。在缺乏脂质体载体时，该DNAzyme能特异地与人巨噬细胞特异生细胞系作用而切割靶mRNA。Vester[21]等将2个α-L-LNA或LNA（Locked nucleic acid）引入10-23 DRz的2个识别臂中而合成了LNAzyme。与未修饰的DNAzyme相比，LNAzyme活性显著升高，且能对天然的含有高级结构的rRNA进行靶向切割。Dass[22]等研究表明3’倒转修饰能显著提高其在体内的稳定性，在人血清（浆）中半衰期达22h，而未修饰的DNAzyme的半衰期仅为70min，且其不影响其细胞摄取和催化活性。Okumoto[23]等研究表明催化核心区第9位C磷酸化可使其催化效率提高近10倍。
如何对脱氧核酶的催化切割活性进行控制和监测是十分重要的。Wang[24]等将效应器引入脱氧核酶中，形成脱氧核酶异构体，其催化活性受效应器控制，在效应器分子存在时其活性可升高30倍左右，该效应器通过调节酶与底物的结合而调控其活性。Ferrari[25]等应用溴乙啶（EB）作为一个外源荧光探针来监测脱氧核酶的动力学活性，亚化学剂量的EB不影响脱氧核酶的活性，该法简便、快速，但只适用于小分子的脱氧核酶和单循环反应时。Mei[26]等合成了一种新的脱氧核酶，该酶将自动化学催化和实时荧光信号联系在一起，使化学催化和荧光信号同步。
迄今为止尚未证实天然的脱氧核酶的存在，但有学者认为在生物界庞大的基因库中，某些天然的DNA序列可能具有酶学活性。目前对脱氧核酶的研究才刚刚起步，但这些人工合成的特殊DNA分子所展示的生物催化功能令人振奋，如何发现DNA新的催化功能和更多种类的脱氧核酶，如何将脱氧核酶发展成为新型基因治疗药物以及基因分析和诊断的工具等，还需要进一步的深入研究。随着全基因寻靶技术和脱氧核酶修饰研究的进展及体内活性评价资料的积累，脱氧核酶完全有可能成为一种新型的基因治疗药物和核酸工具酶。