经典的western方法

互联网2013-09-06

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Western转膜步骤 下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。 I. 所需材料： • Xcell SureLock™或Xcell Ⅱ™ Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051） • 电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cundefined9cm） • 预先切割好的印记膜： 硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001）， PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003） • 转印垫（Cat. No. EI9052） • 甲醇 • 去离子水 • 转移缓冲液（配方见下文） • 用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘 II. 规格： 转印槽尺寸： 14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module容积：约200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot尺寸：约9cundefined9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。 Ⅲ 材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（含20％甲醇的0.5X Towbin） 使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液：去离子水 760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675） 40 ml (25×未稀释液) 甲醇 200 ml 总体积 1000 ml 自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液： Tris 碱 (12mM) 1.45 g 甘氨酸 (96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度） 200 ml 去离子水加至1L 总体积 1L 请参看invitrogen目录648页制备NuPAGE®转膜缓冲液。 b) 制备转印垫－用大约700ml的转印缓冲液浸泡转印垫至饱和，浸泡在缓冲液中时注意挤压转印垫去除气泡，这一步骤是必需的，因为不去除气泡可能会阻碍生物分子的转印。 c) 制备转印膜和滤纸－将选择的转印膜和滤纸按凝胶尺寸裁好或使用预先裁好的膜/滤纸复合层。 • PVDF膜－预先将PVDF膜在甲醇，乙醇或异丙醇中湿润。在去离子水中稍事润洗后，将膜放入含50-100ml转膜缓冲液的浅盘中放置数分钟。 • 硝酸纤维素膜/尼龙膜－直接放入转膜缓冲液中数分钟。 • 滤纸－在临使用前在转膜缓冲液中简单浸泡一下。 • 凝胶－凝胶应在跑完后立刻使用，讨论见下文。不要将凝胶浸泡在转膜缓冲液中。 Ⅳ 制备凝胶及膜的夹层： 凝胶和膜的夹层以及转印垫应放置在转印模块的阴极，使其与转印单元的底部水平。转印垫和组装体就位后，在电极的上方应有约1cm的缝隙（图1）。图1 Cathode core Ⅳ-A. 转印一块凝胶 1. 在电泳后，将切胶刀的斜边楔入胶盒两块板之间的缝隙中，撬开每边的三个粘合点。胶盒的凹口（加样孔）面应面向上。在刀柄上来回推动以分离胶板。在胶盒的各边缘重复直至胶板完全分离。当将切胶刀插入到两块胶板之间时必需小心，以免对凝胶压力过大。 2. 当打开胶盒时，凝胶会粘附在胶盒的一边。小心移除无凝胶的胶板，使凝胶留存在另一块胶板上。用切胶刀切除加样孔。 3. 将一片预先浸泡过的滤纸放在凝胶顶部，刚好在凝胶底部的“底脚”的上部（不覆盖凝胶的底脚）。使用转印缓冲液持续饱和滤纸，确保赶走了进入的气泡。可以使用玻璃移液管作为滚筒，轻轻在表面滚动，从而很容易做到这点。 4. 将胶盒翻转，使凝胶和滤纸面向下放置在戴手套的手掌上或者放有一片Parafilm?膜的干净平面上。使用下面的一种方法将凝胶从胶板上分离： a）如果凝胶在较长（有狭缝）的胶板上，用切胶刀通过胶盒上的狭缝轻推底部，凝胶将很容易从胶板分离。 b) 如果凝胶在较短（有凹口）的胶板上，使用切胶刀小心松凝胶的底部，使凝胶从胶板滑离。 5. 放置到平面上后，使用切胶刀切掉凝胶的“底脚”。 6. 使用转印缓冲液润湿凝胶，将预先浸泡过的转印膜放在凝胶上。确保赶净气泡。 7. 将预先浸泡过的阳极侧的滤纸放置在凝胶上，确保除去进入的气泡。 8. 将预先浸泡过的转印垫放入转印模块的阴极核心。阴极核心是两块核心中较深的一边，其电极板为暗灰色。小心取出凝胶和膜的组装体，按同样顺序放在转印垫上，使凝胶距离阴极最近（图2）。 9. 加入足够的预先浸泡过的转印垫，使其比阴极核心的边缘高出0.5cm。将阳极核心放在转印垫的上面。凝胶/膜组装体应可以稳固在转印模块的两半部分之间，以确保所有组件完全接触。因为转印垫使用多次后会失去弹性，所以可能需要多一块转印垫以确保转印模块的两边完全组合。当转印垫脱色并开始失去弹性时应进行更换。 10. 将转印模块紧紧按在一起，沿滑轨放入电泳槽中。转印模块只能以一种方式进入，所以可以在转印模块的左上角看到阳极标志。如果放置正确，转印模块右手边倒置的黄金柱电极正好插入电泳槽右上方黄金柱电极近邻的孔中。 11. a) 对于Xcell SureLock™:放入张力楔（tension wedge），其垂直面顶住转印模块，将凸柄前压，锁定电泳槽。 b) 对于Xcell Ⅱ™ Mini-Cell：放置前楔（无螺孔），其垂直面顶住转印模块，将后楔滑入，向后推紧。如果放置正确，后楔将不会和电泳槽上沿平齐。在后楔和电泳槽之间会有一个狭缝。 12. 在转印模块中倒入转印缓冲液直至凝胶/膜复合层被转印缓冲液覆盖。不要将液面至顶，这只会增加导电性和热量。 13. 通过电泳槽前端和转印模块前端的缝隙在外槽中加入650ml去离子水。水面距离电泳槽上沿大概2cm。这是用于运行过程中的散热。 14. 在上面放上盖子 15. 在电源关闭情况下，将红色和黑色导线插入电源。 16. 使用上页的条件进行转印。 图2 Single gel membrane sandwich Ⅳ-B 转印两块凝胶 1. 重复步骤1-6（Ⅳ-A）两次，制作两个凝胶-膜组装体。 2. 将两个预浸泡过的转印垫放在转印模块的阴极外壳上。将第一个凝胶-膜组装体按正确的方向放在转印垫上，使凝胶离阴极板最近（图3）。 3. 将另一块预浸泡过的转印垫放在第一块膜复合体上。 4. 将第二个凝胶-膜组装体按正确的方向放在转印垫上，使凝胶离阴极板最近。 5. 进行“转印一块凝胶”中的8-13步。 图3 Tow gel membrane sandwich Western转印的优化 从SDS凝胶中进行Western蛋白转印的优化需要对一系列参数进行考虑。目的是转印所有凝胶上的蛋白并将其定量地转移到转印膜上。进行高效转印需要一定程度的优化，尤其是对于大分子量和小分子量蛋白。 转印后，凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑，在转印时使用第二个“支持膜”，你可以在转膜后染色，以检查是否有穿膜的迹象。如果发现蛋白残留在凝胶上而且膜的结合性很差，可以考虑下列因素： SDS vs 酒精 在多数转印实验步骤中都使用SDS和酒精。但两者对于成功的转印有相反的作用，需要根据欲转印蛋白的性质加以优化。 SDS对于蛋白的迁移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白从凝胶上的转移。但由于膜结合需要疏水相互作用，SDS过多会抑制结合，尤其对于硝酸纤维素膜。如果从蛋白上剥离太多SDS，将无法将蛋白转移出膜。作为一个一般性的规则，如果膜的结合力有效，但蛋白仍旧残留在凝胶上，在转印缓冲液中加入0.01％会促进完全转印。建议的步骤在转印缓冲液中不含有SDS，但凝胶在电泳后不需要浸泡在转印缓冲液中；凝胶中残留的SDS对于有效的转印已经足够。但另一方面，酒精通过在蛋白上剥离SDS促进蛋白和膜的疏水接合。一般在转印缓冲液中加入20％的甲醇会增加硝酸纤维素膜的接合能力。 凝胶浓度 丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移下来。选择可以分离蛋白的浓度最低的凝胶。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白，因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。 凝胶厚度 蛋白比较易于从薄胶上转移下来，所以上样体积允许，使用1.0mm厚的胶取代1.5mm的胶。 电场（电压×时间） 如果电压过低而且转印时间过短，部分蛋白会残留在凝胶上。如果电压过高，小蛋白会在结合到膜上前透膜而出。如果按建议的条件转印后有蛋白残留在胶上，增加电压可能会有帮助，但不要超过5V。但注意，一旦SDS从蛋白剥离，增加转印时间或提高电压就无效果。一旦结合，即使延长转印时间，大部分蛋白也会保持在膜上。 膜的类型 结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。硝酸纤维素膜对于常规使用非常好。对于小的多肽，建议使用小口径的膜。 PVDF比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件。其适用于蛋白测序。 尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合。其SDS耐受度甚至高于PVDF，但也需要更严谨的封闭条件。主要建议用于Northern和Southern。