经典的方案

一、典型的方案

对 于 上 清 液 组 分 ，可 在 低 速 (S 10) 或 高 速 (S 100) 的 条 件 下 进 行 上 样 。一 般 更 倾 向 于在 高 速 条 件 下 上 样 ，因 为 可 以 排 除 核 糖 体 或 微 粒 体 的 干 扰 。所 用 层 析 柱 的 大 小 取 决 于 样品 量 的 多 少 。 一 个 有 用 的 经 验方法则 是 样 品 中 每 100 m g 蛋 白 质 用 I m L 填装 凝 胶 (50〜1 0 0 目）。依 据 生 产 厂 商 (Bio-Rad， Bulletin 1107) 提 供 的 说 明 ，I m L 填 装 的 Affi-Gel Blue可 结 合 11 m g 白 蛋 白 。 一 般 地 ，在 上 述 条 件 下 ，仅 有 总 蛋 白 质 的 5 % 〜 1 0 % 蛋 白 质 可 结 合于 柱 上 ，所 以 ，这 里 建 议 的 蛋 白 质 与 凝 胶 量 的 比 例 足 矣 。然 而 ，对 于 每 种 提 取 物 ，都 应 该 对流 穿 物 质 采 用 特 异 性 分 析 以 确 保 目 标 蛋 白 质 完 全 结 合 于 层 析 柱 。若 不 能 进 行 上 述 分 析 ，
应 适 当 调 整 该 比 率 。直 径 较 大 的 层 析 柱 ，应 该 采 用 较 高 的 流 速 。

我 们 发 现 一 种 缓 冲 液 作 为 起 始 的 层 析 用 缓 冲 液 和 适 当 的 稳 定 剂 比 较 有 效 ，其 配 方 为含 有 0. I m o l / L K C l 的 10 m m o l / L Tris-H C l ， p H 7. 5 。样 品 应 适 应 0•I m o I / L K C 1。与上 述 情 况 类 似 ，该 配 方 条 件 下 ，也 同 样 只 有 不 到 总 蛋 白 质 1 0 % 的 蛋 白 质 量 结 合 于 层 析 柱 。而 且 ，未 结 合 的 核 酸 会 被 清 洗 下 来 。完 成 上 样 之 后 ，继 续 采 用 相 同 的 溶 液 清 洗 层 析 柱 ，直至 洗 脱 液 A 280ra^ 止 下 降 。再 采 用 含 I m o l / L K C l 的 相 同 缓 冲 液 分 批 洗 脱 目 标 蛋 白 质 和结 合 的 蛋 白 质 。尽 管 还 是 会 观 察 到 一 些 拖 尾 现 象 ，但 是 通 常 运 行 2 个 柱 体 积 的 缓 冲 液 足以 将 大 多 数 蛋 白 质 洗 脱 下 来 。多 数 情 况 下 ，这 种 通 用 程 序 已 经 可 以 足 够 去 除 大 多 数 的 核酸 ，使 样 品 得 到 浓 缩 , 并 使 目 标 蛋 白 质 得 到 5〜 1 0 倍 的 纯 化 。

也 可 改 良 该 方 案 以 适 于 更 多 种 样 品 的 纯 化 。用 含 有 一 定 浓 度 K C l 的 溶 液 进 行 中 间洗 脱 步 骤 ，该 浓 度 下 能 够 尽 量 去 除 外 源 性 蛋 白 质 , 而 不 是 目 标 蛋 白质 。之 后 ，可 以 采 用 最低 浓 度 K C l 洗 脱 目 标 蛋 白 质 ，同时必 须 使 其 他 外 源 性 蛋 白 质 仍 处 于 结 合 状 态 。这 种 增 强型 方 案 需 要 进 行 反 复 的 洗 脱 实 验 , 也 会 有 失 败 的 情 况 ，但 通 常 可 以 使 目 标 蛋 白 质 达 到 20倍 的 纯化 。某 些 情 况 下 ，目 标 蛋 白 质 可 能 与 层 析 介 质 结 合 得 十 分 紧 密 ，因 而 需 要 更 强 的 洗脱 条 件 。我 们 发 现 I m o l / L K B r 是 一 个 不 错 的 选 择 ，但 是 ，所 得 的 洗 脱 液 应 快 速 进 行 透析 处 理 ，因 为 可 以 导 致 某 些 蛋 白 质 变 性 。或 者 可 以 选 择 将 K C l 的 浓 度 增 加 到 2 m d /L ，可 能 会 获 得 良 好 效 果 。

M i - G e l Bl u e 层 析 柱 可 以 进 行 重 复 使 用 ，但 是 该 柱 也 应 采 用 若 干 个 柱 体 积 的 2 m o l / L盐 酸 胍 或 1.5 mol/L 硫 氰 酸 钠 进 行 再 生 处 理 ，然 后 用 初 始 的 缓 冲 液 进 行 平 衡 。随 后 可 向 该层 析 柱 加 入 叠 氮 化 钠 ，于 低 温 储 存 。在 上 述 条 件 下 ，层 析 柱 和 树 脂 均 可 稳 定 地 保 存 数 年 。