原理
标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab')2，一个Fab片段与标本中的抗原结合，一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后，再加入铁蛋白与抗体结合，从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后，直接电镜观察。
材料与仪器
病毒材料
抗体 磷钨酸 琼脂糖
高速离心机 铜网 Fomnvar膜 透射电子显微镜 离心管
抗体 磷钨酸 琼脂糖
高速离心机 铜网 Fomnvar膜 透射电子显微镜 离心管
步骤
一、材料及试剂
1. 待检病毒材料 如粪便，气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。
2. 高速离心机
3. 已知抗体
4. 磷钨酸
5. 琼脂糖
6. 其它
二、操作方法
1. 将被检病毒材料0.9 ml，加1︰5～1︰10稀释的特异性免疫血清0.1 ml充分混合。
2. 置37℃作用1 h或37℃1 h后再置4℃过夜。
3. 以17 000 r/min～23 000 r/min离心90 min。
4. 吸去上清，将离心管口倒置于滤纸上，吸去残留液体。
5. 沉淀物中加少量H2O混悬，用3%磷钨酸(pH6.0)负染20 s～30 s，滴加于400目铜网Fomnvar膜上，用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。
6. 在透射电镜下4x104倍观察。
三、结果判定
直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入，大大提高了观察的敏感性。
注意事项
1.固定剂 固定是免疫电镜较关键的一步，免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构，又要考虑到抗原的失活性问题。 固定液的选择：目前，较广泛应用的固定液为醛类：甲醛、多聚甲醛。戊二醛等。有很多研究者应用4%多聚甲醛和0.05%——0.5%戊二醛混合液，联合应用这两种固定液是因为：1.戊二醛在组织中的穿透速度相对多聚甲醛要慢。有些组织（如神经组织）在未及时固定短暂缺氧后就会引起膜结构的破坏，不利于组织超微结构的保存，因而组织需及时、快速的固定，而醛类中以多聚甲醛在组织中穿透最迅速、固定最及时，2.多聚甲醛能较好的保存组织的抗原性，但对组织结构的保存不理想，而戊二醛是一种二醛基双功能试剂，能较好的交联组织蛋白保持组织的超微结构，因而二者经常联合使用。
2. 固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后，不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。 3. 非特异性吸附与酶标抗体、抗血清的稀释度、染色时间，温度及介质等有关，其中最主要的是抗血清及标记抗体的稀释。一般认为高效价抗血清或标记抗体稀释到低蛋白浓度，用于标记染色可获得最理想的结果。
来源：丁香实验
