原理
标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab')2，一个Fab片段与标本中的抗原结合，一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后，再加入铁蛋白与抗体结合，从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后，直接电镜观察。
材料与仪器
病毒材料
抗体 磷钨酸 琼脂糖
高速离心机 铜网 Fomnvar膜 透射电子显微镜 离心管
抗体 磷钨酸 琼脂糖
高速离心机 铜网 Fomnvar膜 透射电子显微镜 离心管
步骤
一、材料及试剂
1. 待检病毒材料 如粪便，气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。
2. 高速离心机
3. 已知抗体
4. 磷钨酸
5. 琼脂糖
6. 其它
二、操作方法
1. 制备免疫复合物。
2. 以生理盐水或pH7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖，趁热浇注于洁净的载玻片上，每片3ml，待冷却凝固后，在凝胶面上等距离放置直径4 mm玻璃珠数粒，再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2 ml～3 ml，冷却凝固后，取出玻璃珠，使凝胶形成凹孔。
3. 将普通滤纸剪成2x3 cm大小，3～4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔，平放在滤纸上。
4. 在凹孔内，加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。
5. 将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用，20 min～30 min后，可将液滴的水分吸干，而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。
6. 在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20 s，过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。
7. 于透射电镜4x104倍下观察。
三、结果判定
直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入，大大提高了观察的敏感性。
来源：丁香实验
