【资源】经典的Western blotting 实战指南以及使用Quantity One定量
丁香园论坛
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来论坛好长时间了,陆陆续续回复了一些帖子,可是回来回去,发现大家提的问题,还是那几个,看过很多总结经验的帖子,要么抄书本,要么人云亦云,缺乏自己的东西,新手参考这些当然难获进益。本人把自己多年的Western blotting实践经验整理一下,欢迎行家批评指正。
首先,摆摆自己的经验。鄙人做WB有8、9年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶;文章嘛,凑数的单篇有上24+,一作单篇15+(系国内完成)
其次,由于一些机缘的因素,在实验室WB体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说实话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了。
再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何缩短操作时间,使实验进行的更有效率也是我们所追求的,因此本文会针对两个普遍采用的却可以看成浪费时间的操作,Bradford法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的WB操作指南是绝无的,
1.样品制备:
(1)变性条件——SDS LB直接裂解:
用常温或者高温预热过(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,但容易遗忘,LB久煮某些性质会改变)的undefinedSDS LB(或者略高1.undefined)直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度,需200ul,其他按平板面积比类推。通常条件下,SDS LB都是过量的(因此不一定要严格参考SDS LB稀释比);如果SDS LB不够,样品核酸、蛋白浓度过高时,煮样后会发现tip吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住tip。这时候常规做法有两种,1. 再煮5min。常规煮样时间3-5min,样品过浓时就煮10min;2.如果10min煮样后,仍然吸不起来,才适当增加SDS LB,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若过长,蛋白会凝固,此时以失去继续WB的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀和水分层)
此方法的缺点,SDS LB煮过的样品如果用来做IP,需要特殊方法,因此,这种制备方法制备的样品有使用局限。
(2)非变性裂解法(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)
裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用。
俺前boss nature文章上的裂解液配方是:20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin, 10μg/mlpepstatin A and 10 μg/ml aprotinin)(此裂解液可用于抽提核蛋白),其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,其实用0.5mM PMSF替代这三种就好了;如果还要做磷酸化蛋白,加1mM Na3VO4(现加现用),10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。
此方法的优点:NaCl浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见,诸如0.15M(生理盐浓度)、0.3M、0.6M(高盐系列,裂解细胞时染色体会析出,细胞碎片和沉淀非常粘稠)及0.8-1.2M;0.3M及以下适合IP试验,0.6M及以上适合纯化蛋白,尤其相互作用较强的复合体,要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。
用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40,用于破坏核膜结构;可用到1%,但此时染色体会析出,沉淀粘稠。
组织块裂解:
组织块较大用匀浆的方法最合适,现在有不少转头很小的匀浆器。
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首先,摆摆自己的经验。鄙人做WB有8、9年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶;文章嘛,凑数的单篇有上24+,一作单篇15+(系国内完成)
其次,由于一些机缘的因素,在实验室WB体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说实话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了。
再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何缩短操作时间,使实验进行的更有效率也是我们所追求的,因此本文会针对两个普遍采用的却可以看成浪费时间的操作,Bradford法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的WB操作指南是绝无的,
1.样品制备:
(1)变性条件——SDS LB直接裂解:
用常温或者高温预热过(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,但容易遗忘,LB久煮某些性质会改变)的undefinedSDS LB(或者略高1.undefined)直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度,需200ul,其他按平板面积比类推。通常条件下,SDS LB都是过量的(因此不一定要严格参考SDS LB稀释比);如果SDS LB不够,样品核酸、蛋白浓度过高时,煮样后会发现tip吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住tip。这时候常规做法有两种,1. 再煮5min。常规煮样时间3-5min,样品过浓时就煮10min;2.如果10min煮样后,仍然吸不起来,才适当增加SDS LB,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若过长,蛋白会凝固,此时以失去继续WB的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀和水分层)
此方法的缺点,SDS LB煮过的样品如果用来做IP,需要特殊方法,因此,这种制备方法制备的样品有使用局限。
(2)非变性裂解法(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似)
裂解细胞请尽量冰上操作,减缓酶解作用。
俺前boss nature文章上的裂解液配方是:20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin, 10μg/mlpepstatin A and 10 μg/ml aprotinin)(此裂解液可用于抽提核蛋白),其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵,其实用0.5mM PMSF替代这三种就好了;如果还要做磷酸化蛋白,加1mM Na3VO4(现加现用),10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。
此方法的优点:NaCl浓度略低于生理状态,保证裂解细胞的方式较为温和,便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见,诸如0.15M(生理盐浓度)、0.3M、0.6M(高盐系列,裂解细胞时染色体会析出,细胞碎片和沉淀非常粘稠)及0.8-1.2M;0.3M及以下适合IP试验,0.6M及以上适合纯化蛋白,尤其相互作用较强的复合体,要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。
用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40,用于破坏核膜结构;可用到1%,但此时染色体会析出,沉淀粘稠。
组织块裂解:
组织块较大用匀浆的方法最合适,现在有不少转头很小的匀浆器。
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