酶切、回收、连接 常识

 

二．多选题

 

 

1 ．重组连接时，反应体系必须的组分有（ A 、C ）

 

A ．Mg²⁺    B. BSA   C. ATP   D. PO₄ ^3-   E . EDTA

 

2 ．DNA 片段重组连接可用下列哪些方法（A 、B 、C 、D 、E ）

 

A ．平末端连接    B. 粘末端连接  C. 加接头连接    D.  同聚尾连接

 

E . T 载体连接

 

3 ．酚抽提法回收DNA 片段后残余的哪些物质可能会影响连接反应（A 、C ）

 

A ．酚  B. 微量的EB  C. 琼脂糖   D. 少量的乙酸钠   E . 少量的乙醇

 

4 ．产生平末端的方法主要有（A 、B 、E ）

 

A ．用产生平末端的限制酶切 。

 

B ．用klenow 片段补齐5 ‘粘末端。

 

C ．用末端转移酶补齐粘末端。

 

D ．用Taq 聚合酶补齐粘末端。

 

E ．用S1 核酸酶降解粘末端。

 

5 ．在DNA 重组连接时，常采用连接头连接（linker ligation ），其作用是（A 、B 、C 、E ）

 

A ．引入某些限制酶切位点。        B.  人工构建载体。

 

C ．增加调控元件。                D.  调整阅读框。

 

E ．通过接头引入与目的基因相同的限制酶位点，并对目的基因相应酶切点进行甲基化修饰保护，可保护目的基因不受限制酶破坏。

 

6 ．构建载体时，使用双酶切相对于单酶切的优点在于（A 、B 、C 、D ）

 

A ．避免载体自身环化   B.  提高连接效率   C.  控制外源基因的插入方向

 

D.  便于转化后的筛选     E . 便于修改阅读框

 

7 ．下列关于同聚物加尾法的说法正确的是（A 、B 、C 、D 、E ）

 

A ．其核心是利用末端转移酶的功能，将载体和外源DNA 的3 ‘端再加上一端寡核苷酸。

 

B ．不易自身环化。  C. 连接效率高       D.  适用于CDNA 克隆

 

E ．可能会产生某种限制酶切位点。

 

8 ．下列与DNA 重组连接相关的说法正确的是 （A 、D 、E ）

 

A ．不匹配的粘末端可通过部分填补后连接。

 

B ． 同聚尾法连接不仅连接效率高，也易回收插入的片段。

C ．限制酶切割DNA 后加入EDTA-SDS 终止液抑制限制酶活性，将有利于重组连接。

 

D ．Mg²⁺ -ATP 是T₄ DNA 连接酶反应时的必须因素。

 

E ．平末端连接时，在反应体系中加入适量凝聚剂可提高连接效率。

 

9 ．下列哪些因素对保证较高连接效率是有利的（A 、C 、D ）

 

A ．高纯度DNA 。

 

B ．载体与目的基因摩尔数之比为1 ：1 。

 

C ．载体与目的基因摩尔数之比为1 ：3~5 。

 

D ．连接反应体系中DNA 浓度较高。

 

E ．连接反应体系中DNA 浓度较低。

 

10 ．如果DNA 分子重组时，需要用平端连接，下列哪些方法可形成平末端（B 、C 、D 、E ）。

 

A ．3 ‘突出的粘末端用DNA 聚合酶加dNTPs 填平。

 

B ．3 ‘突出的粘末端用核酸酶切平。

 

C ．5 ‘突出的粘末端用DNA 聚合酶 加dNTPs 填平。

 

D ．5 ‘突出的粘末端用核酸酶切平。

 

E ．利用切口为平末端的限制酶。

 

 

 

三、填空题

 

1 ．形成平末端的方法有 用产生平末端的限制酶切 ，用 S1 核酸酶切除粘末端 ，用 DNA 聚合酶填平粘末端 。

 

2 ．载体与CDNA 连接重组可用的方法有 同聚尾连接酶 ，加人工接头连接法 。

 

3 ．DNA 片段重组连接时，如要克隆PCR 产物，PCR 产物可直接用 T 载体连接，而无须用限制酶处理。

 

4 ．回收DNA 片段时，在确定DNA 条带位置时，应使用 长 波长紫外灯，以最大限度减少对DNA 的照射损伤。

 

5 ．回收DNA 片段时，常用 正丁醇 处理以除去EB 。

 

6 ．在用单一限制酶切载体和目的基因并进行连接时，为防止载体自身环化，常用 碱性磷酸酶 处理载体，或用 α - 互补 进行筛选。

 

7 ．DNA 片段重组连接的方法主要有 平端连接 、粘端连接 、同聚尾连接 、加接头连接 。

 

 

 

四．简答题

 

1 ．如何将一平末端的DNA 片段与BamH I 形成的粘末端连接？

 

答：使用加接头连接法。人工合成一段含BamH I 酶切位点的DNA 短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用BamH I 切割连接片段，即可形成BamH I 的粘末端。

 

2 ．什么是同聚尾连接法？具有哪些优缺点？

 

答：同聚尾连接法是利用末端转移酶在载体和外源DNA 的3 ‘端各加上一段互补的寡聚核苷酸，形成人工粘性末端，然后在DNA 连接酶的作用下，连接成重组DNA 。

 

其优点在于（1 ）由于同一DNA 两端粘尾相同，不会自身环化；（2 ）连接效率高；（3 ）用任何一种方法制备的DNA 都可用这种方法连接。

 

其缺点在于（1 ）方法复杂；（2 ）外源片段较难回收；（3 ）由于添加了同聚尾，可能会影响外源基因表达。

 

3 ．什么是接头连接法？

 

答：人工合成或来源于某一质粒的小段含某限制酶位点的DNA 与载体或外源DNA 分子相连，这样便在载体或外源DNA 上制造出新的酶切位点，即接头连接。

 

4 ．为什么用同裂酶进行体外重组效率最高？

 

答：同裂酶是指来源不同的限制酶切割DNA 后，产生相同的末端。多数同裂酶产生的粘性末端并非完全一致而是有四个碱基相同，这样用同裂酶切割载体和目的基因后的连接产物常会失去原有的限制酶位点，这样用同裂酶进行重组时，限制酶切割反应后不用将该酶失活，即可直接进行重组连接，由于连接体系中原有限制酶存在，载体自连不会发生，从而保证了载体只同外源DNA 的连接。