与做荧光染色的同学共享些经验

Hoechst 33258染色
固定液 50 ml
Hoechst 33258染色液 50 ml
抗荧光淬灭封片液 5 ml
说明书 1 份

保存条件：
4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效。

注意事项：
Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
Ø 需PBS或0.9%NaCl溶液。
Ø 需盖玻片与载玻片。
Ø 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。
使用说明：
1. 贴壁细胞
A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。
B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。
C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。
G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。

2. 悬浮细胞
A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。
B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。
C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。
F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左.

3. 组织切片
A. 对于任何常见切片，处理至常规可以进行免疫染色时，或完成常规的免疫染色后，即可进行后续的Hoechst染色。
B. PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。
C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。
D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
E. 将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，
Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱。

DAPI染核
原理：
主要结合dsDNA；结合小沟的AT。DAPI也结合RNA，但其发射峰波长（500nm）要长于DAPI/dsDNA（460nm）。
DAPI dilactate更水溶。在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时，下述方法可加以修改。
保存：
    10mg/单位，室温避光保存，小瓶内至少一年。制stock液，溶解100uM （DAPI dihydrochloride二盐酸化物分子量为350.3；DAPI dilactate分子量为457.5）DAPI于去离子水中或DMF(二甲基甲酰胺)，4℃避光可保存6个月。
DAPI是诱变剂，水溶液可通过活性炭去除，要安全处理。
染色：
在所有染色完成后进行复染，不需要另外的固定和通透处理。
荧光显微镜复染方法：
1.        PBS平衡
2.        PBS稀释DAPI stock液至300nM，滴加300μL这种稀释液于细胞上。
3.        孵育5分钟。
4.        PBS中涮洗几次，�干过量缓冲液，抗淬灭剂封片。
FISH复染：
样品在dH2O中洗以去除残留缓冲盐溶液，有助于减少玻片上非特异背景。
1.        PBS中稀释至30nM，吸300μL滴于样品上，塑料玻片有助于平均分配染料。
2.        黑暗室温孵育30分钟。
3.        去掉盖玻片，PBS和dH2O中小心盥洗。
4.        去掉过量液体，绵纸在样品边缘小心吸取。
5.        盖上盖玻片，蜡或指甲油封片。或按供应商的指导加抗淬灭剂。
荧光显微镜观察。



Rhodamine 123 染色
中文名称：罗丹明 123
目    的：测细胞内线粒体的跨膜电位
EX/EM：  505/534
染液配制： 罗丹明123 粉剂用甲醇配制成1mg/ml的储备液，100ul/支分装，-20℃保存。染色时用Dulbecco’s PBS缓冲液将其稀释为5ug/ml。
染色步骤：
培养细胞

Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次(缓冲液预热至室温或37℃)

Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育1小时

Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次

加0.5ml Dulbecco’s PBS，上机测量

Fluo-3-AM 染色 (测细胞内游离钙离子浓度)
原理：
AM酯的羧酸经修改不带电荷，易浸入细胞。一旦进入细胞，亲脂性集团被非特异酯酶切断，使其带电荷，从而溢出细胞大大减慢。一般，酯化集团水解对于结合靶离子是必须的。AM酯水解显颜色或荧光的特点可用于检查其自发水解。

保存：
指示剂干燥避光4℃或-20℃可长期保存。
AM酯易水解，发货瓶中至少可放六个月。
用时AM应溶解于无水DMSO，并尽快使用（一周内），否则细胞运载能力下降。AM的DMSO储备液应避光、冷冻、干燥保存。盐的储备液应用蒸馏水或缓冲液制备，冷冻-20℃避光保存，可放6个月。
应用：
用细胞浸透AM酯运载技术：
1.在生理缓冲媒介中将DMSO稀释至1-5μM。不可用含胺的缓冲液如Tris。
2.有机阴离子转运抑制剂苯甲酸（1－2.5mM）或sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)可加入细胞外液以减少指示剂去酯后的渗漏。苯甲酸和sulfinpyrazone是很碱性的，所以之后要重调pH值。
3.AM酯孵育细胞一般在20－37℃，15－60分钟，准确的浓度，时间和温度靠经验摸索。AM酯运载技术有一个内在问题即亚细胞隔阂，降低孵育温度可以减轻这一副作用。
4.检测荧光前，建议细胞最好在无指示剂媒介中（最好有阴离子转运抑制剂）洗，以去掉细胞表面的非特异吸附的染料。而后再孵育30分钟来进一步使细胞内AM酯完全脱掉。荧光素泄漏引起的背景高可以在实验前在细胞外加入抗荧光素抗体来防止。
目    的：测细胞内游离钙离子浓度
EX/EM：探针在细胞外液无荧光，进入细胞后最大激发波长和发射波长为464/526

方法一：
染液配制：Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM浓度 1mM)，15ul/支分装，-20℃保存。染色时用15～50mM HEPES缓冲液将其稀释为1～20uM(如1.5ml 为10uM)。
染色步骤：
培养细胞

缓冲液漂洗2～3次

Fluo-3-AM (1～20uM) 37℃或室温孵育0.5～1小时

缓冲液漂洗2～3次

加0.5ml 缓冲液，上机测量