【公告】讲述western实验中的酸甜苦辣,交流经验,共同学习
丁香园论坛
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国内做western的实验室现在很多,但是western因为是历时比较长,试剂多,总是出现各种各样的问题,园子里帖子很多,讲述经验的,在这发帖主要是想让大家抒发一些做western的感受以及感觉实验的key point是什么,最容易犯的错误是什么,希望大家踊跃发音,其中附一篇网上及园子里流传很广的一篇文章,希望大家多多跟帖,发表自己的感想
这是园子里的一篇帖子,非常欣赏,转过来,希望大家多写写,主要是1 key point 2最容易犯得错误 3 解决的方法
穷人的劳斯莱斯-我的五年western blot体会 - 丁香园论坛 (转载)
1.抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气,对于我所在的兰州地区的实验者而言,感触尤深。在这五年的western blot实验历程里,我先后用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失:abcam品种全,质量过硬,但价高(3400元/100微升),而且说是100微升,但至多能吸出来90微升;Sigma的价最贵;比较有性价比的是CST的抗体,现在好像是2200元/100微升,我前后用过二十几种, 1:1000的稀释比下,还没有失过手,100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验,还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升,唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少,呵呵,毕竟是穷人(420元/100微升),大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对(抗体品种,货号等完全一致),在都能做出来的前提下,原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年,不敢说出来,我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖,也会有所不同。揣测归揣测,假如只为了发论文毕业走人,可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化,怎么说呢,应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体,再用抗原亲和纯化。效价非常不错,夸张的时候1:10000都能做出条带,唯一的麻烦是兔子太骚(骚臭),不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲,老板又特别想拥有手工作坊的情况下,可以自己伺候折腾兔子来玩玩,刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗,是不是可以写成论文毕业,估计因校而异了。
2.Western Blot设备
目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶,但通常用不上,由此造成垂直缓冲液的浪费,而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽,容易漏液,塑料夹应该是有疲劳寿命的,估计日子一长,弹性就会改变,所以如果你们实验室刚买了MINI4,赶紧用,遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。
Biorad的一套系统得两万多,西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明,上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样,而且可以通用,不带电泳仪是5千多一套,挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐,胶架容易断裂。不过仔细算算,三套天能也就是一套伯乐的价格,值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用,但垂直槽配胶不方便,玻板太厚,散热不好,但能用,六一的电泳仪(电源)还是很好用的。
3. Western Blot实验条件
Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的,按以下的网址下载下来就可以了(http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf)。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货,配出来的胶可以提在手里玩,弹性非常好,价格比sigma的便宜许多,1公斤好像是480多人民币,够实验室用好长时间,现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶,很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了,兰州的代理是上海生工。
要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用,具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。
转膜我通常是快转两百200毫安/2小时,慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴,就是把槽子泡在冰水混合液里。
封闭我通常用BD的脱脂奶粉,不归,260元500克,也是从北京华美买的。
ECL我用pierce的,500毫升1650元,比国产的还便宜好用。
胶片是柯达的,以前用过乐凯的,不如柯达。
我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶,总觉得是脱裤子**的事。
4. Western Blot实验关键
Western Blot操作步骤多,每一步的失误都会造成全盘失败,综合而言,抗体仍然是决定成败的关键,如果抗体很滥,就是神仙也没招。其中内参抗体很重要,因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin,Tubulin,GAPDH我都用过,Actin,Tubulin的缺点是有时候会出现复带,比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell,nature,science上的文章,大多用GAPDH做内参。进口的,国内分装的,国产的,我都用过。进口的最强的1:10000都能做出条带(Upstate,现在被Minipore招安了),国内分装的也好用,但就是不好回收重复使用,国产的一般只能用一次。我要特别强调的是,实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体,因为只要Western Blot开工,每次都得用内参抗体,而一般目的蛋白的抗体也就用几次,重复三次就了事。但内参抗体是不折不扣的耗材,严格意义上将,每跑一次胶,就得杂一次内参,使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体,但好像因为种属同源性太高,背景总是不干净。进口的好,太贵;国产的只能使用一次,年终算账,不比进口的便宜。我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事,为什么国内企业高的早不了,低的造不好呢?现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗,200微升420元钱,我在蛋白上样量12微升/孔的情况下,按1:2000稀释比,条带非常清晰,没有杂带,是我目前用过的最好的国产抗体,我估计按1:4000照样能做出来,因为按按1:2000稀释做,在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交,可回收重复使用5到6次。最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至(当时名叫杭州松华)发布的广告,我就怂恿实验室主管买了2支,很好用,现在实验室都没有用完 ;2009年我的一个朋友做western,我推荐他又买了1支,做出来的效果确实好,2009年底我到了新的实验室,western的全套我在新实验室重新建立,啥都采购齐了,可就是买不到杭州松华的内参抗体,我上网再也找不到这个公司的网页了,没办法,只好一直噌朋友的内参抗体用。我有个陋习,就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。还好,今年7月份我终于找到了当年的通讯记录,一联系才知道他们改名叫杭州贤至生物科技有限公司了,呵呵,改了个名,害我找了大半年。第三次买到的GAPDH内参抗体,还是好用,1:2000,条带清晰,回收重复用,照样work,截止目前,我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的,嘿嘿!草根出生,我也照样有我穷人的劳斯莱斯。
这是园子里的一篇帖子,非常欣赏,转过来,希望大家多写写,主要是1 key point 2最容易犯得错误 3 解决的方法
穷人的劳斯莱斯-我的五年western blot体会 - 丁香园论坛 (转载)
1.抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气,对于我所在的兰州地区的实验者而言,感触尤深。在这五年的western blot实验历程里,我先后用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失:abcam品种全,质量过硬,但价高(3400元/100微升),而且说是100微升,但至多能吸出来90微升;Sigma的价最贵;比较有性价比的是CST的抗体,现在好像是2200元/100微升,我前后用过二十几种, 1:1000的稀释比下,还没有失过手,100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验,还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升,唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少,呵呵,毕竟是穷人(420元/100微升),大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对(抗体品种,货号等完全一致),在都能做出来的前提下,原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年,不敢说出来,我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖,也会有所不同。揣测归揣测,假如只为了发论文毕业走人,可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化,怎么说呢,应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体,再用抗原亲和纯化。效价非常不错,夸张的时候1:10000都能做出条带,唯一的麻烦是兔子太骚(骚臭),不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲,老板又特别想拥有手工作坊的情况下,可以自己伺候折腾兔子来玩玩,刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗,是不是可以写成论文毕业,估计因校而异了。
2.Western Blot设备
目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶,但通常用不上,由此造成垂直缓冲液的浪费,而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽,容易漏液,塑料夹应该是有疲劳寿命的,估计日子一长,弹性就会改变,所以如果你们实验室刚买了MINI4,赶紧用,遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。
Biorad的一套系统得两万多,西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明,上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样,而且可以通用,不带电泳仪是5千多一套,挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐,胶架容易断裂。不过仔细算算,三套天能也就是一套伯乐的价格,值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用,但垂直槽配胶不方便,玻板太厚,散热不好,但能用,六一的电泳仪(电源)还是很好用的。
3. Western Blot实验条件
Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的,按以下的网址下载下来就可以了(http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf)。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货,配出来的胶可以提在手里玩,弹性非常好,价格比sigma的便宜许多,1公斤好像是480多人民币,够实验室用好长时间,现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶,很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了,兰州的代理是上海生工。
要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用,具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。
转膜我通常是快转两百200毫安/2小时,慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴,就是把槽子泡在冰水混合液里。
封闭我通常用BD的脱脂奶粉,不归,260元500克,也是从北京华美买的。
ECL我用pierce的,500毫升1650元,比国产的还便宜好用。
胶片是柯达的,以前用过乐凯的,不如柯达。
我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶,总觉得是脱裤子**的事。
4. Western Blot实验关键
Western Blot操作步骤多,每一步的失误都会造成全盘失败,综合而言,抗体仍然是决定成败的关键,如果抗体很滥,就是神仙也没招。其中内参抗体很重要,因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin,Tubulin,GAPDH我都用过,Actin,Tubulin的缺点是有时候会出现复带,比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell,nature,science上的文章,大多用GAPDH做内参。进口的,国内分装的,国产的,我都用过。进口的最强的1:10000都能做出条带(Upstate,现在被Minipore招安了),国内分装的也好用,但就是不好回收重复使用,国产的一般只能用一次。我要特别强调的是,实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体,因为只要Western Blot开工,每次都得用内参抗体,而一般目的蛋白的抗体也就用几次,重复三次就了事。但内参抗体是不折不扣的耗材,严格意义上将,每跑一次胶,就得杂一次内参,使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体,但好像因为种属同源性太高,背景总是不干净。进口的好,太贵;国产的只能使用一次,年终算账,不比进口的便宜。我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事,为什么国内企业高的早不了,低的造不好呢?现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗,200微升420元钱,我在蛋白上样量12微升/孔的情况下,按1:2000稀释比,条带非常清晰,没有杂带,是我目前用过的最好的国产抗体,我估计按1:4000照样能做出来,因为按按1:2000稀释做,在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交,可回收重复使用5到6次。最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至(当时名叫杭州松华)发布的广告,我就怂恿实验室主管买了2支,很好用,现在实验室都没有用完 ;2009年我的一个朋友做western,我推荐他又买了1支,做出来的效果确实好,2009年底我到了新的实验室,western的全套我在新实验室重新建立,啥都采购齐了,可就是买不到杭州松华的内参抗体,我上网再也找不到这个公司的网页了,没办法,只好一直噌朋友的内参抗体用。我有个陋习,就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。还好,今年7月份我终于找到了当年的通讯记录,一联系才知道他们改名叫杭州贤至生物科技有限公司了,呵呵,改了个名,害我找了大半年。第三次买到的GAPDH内参抗体,还是好用,1:2000,条带清晰,回收重复用,照样work,截止目前,我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的,嘿嘿!草根出生,我也照样有我穷人的劳斯莱斯。