趋化因子CCL20和CTSD/CTSB怎么共同孵育，怎么继续做Western实验

想要在硬骨鱼中重复一篇文献中的实验，这篇文献中的实验主要是研究组织蛋白酶B和D对趋化因子CCL20的切割作用。下面是一些可能有用的步骤：

共同孵育：共同孵育是将两种蛋白质一起孵育的实验步骤，目的是研究它们之间的相互作用。在共同孵育前，需要确定孵育的最佳条件，如温度、时间和缓冲液等。对于硬骨鱼中的组织蛋白酶和CCL20，可以先尝试在不同的缓冲液中进行共同孵育，例如PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。通常，共同孵育的时间在1-2小时左右，温度在37°C左右。

样品制备：在进行共同孵育前，需要将组织蛋白酶和CCL20的复性蛋白制备好，并进行质量检测。如果您的目的是进行Western blot检测，那么需要将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液中，将其沸腾5-10分钟，使其变性，并使样品中的蛋白质全部变为线性状态。

免疫印迹：在进行Western blot检测前，需要将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，并用特异性抗体探测目标蛋白。对于硬骨鱼中的组织蛋白酶和CCL20，需要寻找特异性的抗体，如抗组织蛋白酶B或D的抗体和抗CCL20的抗体。

总之，共同孵育和Western blot检测是两个独立的步骤，在实验过程中需要分别进行。需要先确定共同孵育的最佳条件，然后将孵育后的样品用Western blot检测。

1. 准备细胞：选择所需要的细胞，例如小鼠巨噬细胞，肾脏细胞等，并培养在适当的培养基中。

2. 添加CCL20：将CCL20添加到培养基中，并根据需要的浓度进行调整。CCL20是一种趋化因子，它可以引导特定的细胞迁移和定位。

3. 添加CTSD/CTSB：将CTSD和CTSB加入到培养基中，并根据需要进行调整。这两种酶都是蛋白水解酶，它们参与细胞中的许多生物学过程。

4. 孵育期间观察：将细胞和添加物进行孵育，在一定时间内观察细胞的形态变化、迁移行为以及相关信号通路的激活。

5. 分析结果：利用适当的实验方法，如免疫荧光染色和Western blot等，检测细胞中的特定蛋白表达水平的变化。

从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂（如7.0mol/L盐酸胍、8.0mol/L脲）溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。