【共享】菜鸟做ELISA实验操作体会

菜鸟做ELISA实验操作体会
1.标本收集：这个很关键呀！标本收集及保存的好坏，直接决定了实验能否成功。在收集标本之前必须考虑到实验对标本收集及保存的要求，这些要求对标本中待测物质稳定性影响很大。以ELISA为例。ELISA检测的一般是液态标本，应在收集到新鲜标本后立即离心留取上清液1ml左右移入高温灭菌过的1.5ml EP管中。这种标本在4度保存48小时，-20度保存1个月，-80度保存6个月对检测影响不大。样本一般都是怕反复冻融的，这样会使蛋白降解，如需做预实验或需反复取用标本时，应在收集时即分装几个EP管（管外注意用标号笔标记好，不然就会驴唇不对马嘴了！）。不注意这些要求，即使实验做的再漂亮也是瞎的，不大会出结果。
2.实验前的准备工作那是相当的重要。要用到的100ul中枪头、1000ul大枪头、1.5ml EP管事先灭菌好是必须的；多次使用的酶标板框洗净烘干；
3.备齐用品：100ul加样枪及枪头，1000ul加样枪及枪头，100ml量筒（洗净并双蒸水冲洗），500ml量杯（洗净并双蒸水冲洗，实验室没有更小的了），双蒸水100ml（稀释洗涤液用），吹气球，吸水纸（定性滤纸），试管架，避光湿盒，酶标板框，定时器，胶带，剪刀，弃物盒及废液缸；
4.准备实验时进入实验室即打开37度恒温箱让它开始升温，不然等到需要用时再打开，你急它不急，它升温需要时间，可能已经过了要温育的时间它才达到37度；样品和试剂盒在室温下平衡30分钟以上；
5.ELISA试剂盒固化的抗体在底部，加样时枪头千万不要碰到底部；用不完整个试剂盒可以分开用，但分时一定不要摸底部，原因同前；
6.实验前最好自己写一个操作步骤，把操作中注意事项写清楚。不要只看着试剂盒说明书做，因为说明书是把操作程序和注意事项分开写了，看不过来，另外说明书上很多东西毕竟写的不具体，网上的经验参考也要写在操作步骤里，越详细越好；
7.一般一批标本只会使用部分试剂和微孔板，事先计算好需要的试剂量，分别用1ml注射器抽取比需要量多做3-5个标本的试剂转移到标记好的1.5mlEP管中，注意1ml注射器不要混用，做到一剂一个注射器。另外显色液B要避光，转移时关灯，放的EP管用黑纸包住；
8.加样枪的使用：使用前调整加样枪加样量（如我的ELISA试剂盒一般是50ul），吸试剂时按到有阻力感就行了，如果按到底，加样量一定超过枪上标示的量了；打出试剂时按到有阻力感后继续下按到底以便排尽枪头中的试剂；加显色剂B时要关灯并且迅速，加好后用避光袋包住或放在避光湿盒中再孵育；加样时尽量避免产生气泡，如有气泡成生，可用吹气球吹破之；
9.每次孵育时用胶带封住酶标板口，防止水份蒸发；
10.微孔板一般是一排8个，在其一端排头的边缘用记号笔标记下顺序（如1，2，3...），以免手工洗板过程中板朝下拍时不慎致微孔板掉出酶标板框而无法确认顺序；
11.加标准品和样品时每次都要更换一个枪头，避免重复使用枪头而交叉污染；
12.37度温育后千万不要忘记倒掉微孔板中的液体（包含未结合上的酶联亲和物，其残留必然造成假阳性），并且反复用稀释好的洗涤剂洗板；洗板可以多洗几次，没坏处；
13.洗板可用50ml或20ml注射器针管+1ml注射器针头抽洗涤液直接往微孔中冲洗，注意针头安牢，不然压力大时把针头冲到微孔里划到孔底，大量洗涤剂冲入就不好玩了。
14.应做预实验和标准曲线，如果多数样本测值在最高OD值处波动，要稀释后再重做，然后按稀释倍数算出来最终结果，因为试剂盒是有测试范围的。