做 ChIP 的心得体会

做 ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）已经几个月了，虽时间不长，但深刻体会细节决定成败，这里就把自己认为值得注意的细节总结如下：

1、cell counting：尽量做到准确，会影响 input 结果。

2、cross link：甲醛的终浓度是 1%，这个基本所有的 protocol 上都会强调。

3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的 tip 头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的 sonication 就麻烦了。

4、sonication：ChIP 中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的 sonication，然后建议采用 EZ-ChIP 上推荐的方法看看 sonication 的效果如何。

5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or G 之前要先混匀，因为salmon sperm DNA 是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现 beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。

6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用 gel loading tips 吸。

7、含 beads 的 samples 离心时，有的 protocol 上推荐是 1000rpm，45 秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads 破碎。（当然如果采用的是 magnetic 的 beads 就不存在这个问题）

8、reverse crosslink 可以是 65°4 个小时，也可以 overnight。

9、reverse crosslink 后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。

10、每次行 real time PCR 之前都要把 sample 离心保证取样的准确。

11、1~10ul 的取 3ul 以上才比较准确，所以考虑好自己 PCR 反应体系的配置。

12、一个 ChIP 一般需要 3~4 天的时间，其中有几个步骤是可以停下来的：

1）细胞收集：用含蛋白酶抑制剂的 PBS 洗涤离心，去上清的细胞收集液可置 -80° 冻存；

2）用 SDS 重悬细胞后可置 -80° 冻存；

3）sonication 结束，离心后的上清置新的离心管后可 -80° 冻存；

4）reverse cross-link 后的标本可 -80° 冻存。

13、agarose beads 的 wash 过程中以及后面的 DNA 提取过程中乙醇的 wash，可以用细胞室的那种吸引器，接上 200ul 的 tip 头吸，这样会节省很多时间（每个实验室情况可能不一样）。

14、DNA 提取后建议用水溶解 DNA，因为 TE buffer 里的 EDTA 可能会影响 PCR 反应体系中的 Mg2+。

15、溶解 DNA 的水量可以根据 PCR 反应体系的要求适当调整。