蛋白质的双向电泳实验方法

第一向（等电点聚焦， IEF ）

1 ）凝胶条的准备

1． 以帽凝胶端（ 2 个校准环： 4mm 和 10mm ）朝下，将 4 根玻璃管插入两个凝胶灌注装置的每个托架中，这样玻璃管恰好站在两个分隔室之一的“充填船”上。从玻璃管顶端到玻璃管底端拉入 PP 线（小心，线不易移动），否则以后将不能用它们将胶溶液拉上来。

2． 溶解分离胶溶液和过硫酸铵溶液。必须监控凝胶溶液的温度，因为高温下（大于 25 ℃）聚合作用太快。

3． 分离胶溶液除气 4 分钟，在桌子边缘轻弹玻璃管壁，避免产生气泡。

4． 融化帽凝胶溶液，除气，步骤同 3 。

5． 用 Gilson 移液管加 35 μ l APS 到 1365 μ l 分离胶溶液中，溶液应小心摇晃，避免氧气进入胶内。

6． 将分离胶溶液加到两个凝胶灌注装置的每一个充填船里（每 4 个管 700 μ l ）。所有的玻璃管末端都必须浸没于凝胶溶液中。

7． 小心将 PP 线抽出，将凝胶溶液拉上至 23mm 的标记。

8． 换充填船分隔室。

9． 使用一个 Gilson 移液管，加 10 μ l 0.8 ％ APS 到 390 μ l 帽凝胶溶液中，轻轻振荡使之混匀。

10．  在两个凝胶灌注装置的每个充填船中的空余分隔室内加入 200 μ l 帽凝胶溶液；凝胶溶液应到达 17mm 的标记。

11．  移去充填船，允许凝胶溶液到达 13mm 的标记。经过这一步，有空气进入管子底端和 4mm 标记处。

12．  聚合 30 分钟后，将 PP 线抽出，去除凝胶表面未聚合的溶液。在毛细血管口部滴加一大滴去离子水，这样在凝胶的上边形成一个潮湿的室，在凝胶和水滴之间形成一个气泡。用此方法形成一个潮湿的室，随后用 Parafilm 膜封上帽凝胶一侧。凝胶在室温过夜，可以使之进一步聚合。制备好的管子如果保存于室温，可以在第二天使用，或最迟在制备好第五天使用。

2 ）加样

1． 将乙二胺加入阴极溶液，除气 5min ，下槽装阴极溶液。

2． 融解 Sephadex 溶液，加入 108mg 尿素和 10 μ l 两性电解混合液到 100mg Sephadex 胶中，在涡旋器上充分振荡 10 ～ 15 分钟。

3． 从凝胶灌注装置移走凝胶管，把它们插入聚焦槽的阳极部分，仍应看到 13mm 标记。帽凝胶一端朝上。

4． 将阴极溶液加入管子的阴极一边，不要有气泡（事先已除去水）。

5． 将聚焦槽的阳极部分安放到聚焦槽的底部，管子必须浸入阴极溶液。

6． 除去水，并将加样侧干燥。使用一个伸长的巴斯德移液管或凝胶装填移液管头将水吸去，然后用滤纸条将凝胶表面干燥。

7． 融解准备好的样品和覆盖溶液。

8． 用凝胶装填移液管头，迅速在胶上覆盖大约 2mm 厚的 Sephadex 。

9． 用一个凝胶装填移液管头，装入样品（ 1 ～ 15 μ l ），加到 Sephadex 表面。加样时，尖端必须接触 Sephdex 表层，样品应小心加入，避免气泡。

10．  使用凝胶装填头，轻轻在样品上加入 5 μ l 覆盖液并分层，不要使覆盖液和样品相混合。然后在毛细血管中加入阳性溶液，不要引入气泡。

11．  所剩的阳极溶液加入上槽，用缓冲液覆盖所有的管子。

3 ） IEF 电泳

电泳应分段升高以按下表获得 Vh （电压×小时）乘积为 1841 ：

凝胶平衡

1． 融解平衡溶液（在 IEF 结束前 1 小时）。使用之前，在 20ml 平衡溶液中加入 0.2g DTT 。

2． IEF 结束后，移去管子中的阳性和阴性溶液。

3． 用 87 ％的甘油溶液覆盖帽（ cap ）凝胶一侧。

4． 加 5ml 平衡溶液到 Petri 盘。

5． 用 PP 线挤出凝胶： PP 线从帽凝胶一侧插入，管子加样一侧浸入去离子水，小心地向下挤出凝胶。与此同时可看到水中的覆盖液的溶解。凝胶被拉出 5min 后，用水迅速清洗挤压端。然后将管子保持在盛有平衡溶液的 Petri- 盘子上，整个凝胶被 PP 线拉到盘子里。每个盘子里可平衡两块胶。

6． 室温振荡平衡凝胶 10 分钟整。

7． IEF 之后，如果凝胶并不立刻使用，应倒出平衡缓冲液，并在 Petri 盘中－ 70 ℃保存。－ 20 ℃保存导致分辨率降低；液氮保存将破坏凝胶。