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蛋白质的双向电泳实验方法

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835

第一向(等电点聚焦, IEF

1 )凝胶条的准备

1. 以帽凝胶端( 2 个校准环: 4mm 10mm )朝下,将 4 根玻璃管插入两个凝胶灌注装置的每个托架中,这样玻璃管恰好站在两个分隔室之一的“充填船”上。从玻璃管顶端到玻璃管底端拉入 PP 线(小心,线不易移动),否则以后将不能用它们将胶溶液拉上来。

2. 溶解分离胶溶液和过硫酸铵溶液。必须监控凝胶溶液的温度,因为高温下(大于 25 ℃)聚合作用太快。

3. 分离胶溶液除气 4 分钟,在桌子边缘轻弹玻璃管壁,避免产生气泡。

4. 融化帽凝胶溶液,除气,步骤同 3

5. Gilson 移液管加 35 μ l APS 1365 μ l 分离胶溶液中,溶液应小心摇晃,避免氧气进入胶内。

6. 将分离胶溶液加到两个凝胶灌注装置的每一个充填船里(每 4 个管 700 μ l )。所有的玻璃管末端都必须浸没于凝胶溶液中。

7. 小心将 PP 线抽出,将凝胶溶液拉上至 23mm 的标记。

8. 换充填船分隔室。

9. 使用一个 Gilson 移液管,加 10 μ l 0.8 APS 390 μ l 帽凝胶溶液中,轻轻振荡使之混匀。

10. 在两个凝胶灌注装置的每个充填船中的空余分隔室内加入 200 μ l 帽凝胶溶液;凝胶溶液应到达 17mm 的标记。

11. 移去充填船,允许凝胶溶液到达 13mm 的标记。经过这一步,有空气进入管子底端和 4mm 标记处。

12. 聚合 30 分钟后,将 PP 线抽出,去除凝胶表面未聚合的溶液。在毛细血管口部滴加一大滴去离子水,这样在凝胶的上边形成一个潮湿的室,在凝胶和水滴之间形成一个气泡。用此方法形成一个潮湿的室,随后用 Parafilm 膜封上帽凝胶一侧。凝胶在室温过夜,可以使之进一步聚合。制备好的管子如果保存于室温,可以在第二天使用,或最迟在制备好第五天使用。

2 )加样

1. 将乙二胺加入阴极溶液,除气 5min ,下槽装阴极溶液。

2. 融解 Sephadex 溶液,加入 108mg 尿素和 10 μ l 两性电解混合液到 100mg Sephadex 胶中,在涡旋器上充分振荡 10 15 分钟。

3. 从凝胶灌注装置移走凝胶管,把它们插入聚焦槽的阳极部分,仍应看到 13mm 标记。帽凝胶一端朝上。

4. 将阴极溶液加入管子的阴极一边,不要有气泡(事先已除去水)。

5. 将聚焦槽的阳极部分安放到聚焦槽的底部,管子必须浸入阴极溶液。

6. 除去水,并将加样侧干燥。使用一个伸长的巴斯德移液管或凝胶装填移液管头将水吸去,然后用滤纸条将凝胶表面干燥。

7. 融解准备好的样品和覆盖溶液。

8. 用凝胶装填移液管头,迅速在胶上覆盖大约 2mm 厚的 Sephadex

9. 用一个凝胶装填移液管头,装入样品( 1 15 μ l ),加到 Sephadex 表面。加样时,尖端必须接触 Sephdex 表层,样品应小心加入,避免气泡。

10. 使用凝胶装填头,轻轻在样品上加入 5 μ l 覆盖液并分层,不要使覆盖液和样品相混合。然后在毛细血管中加入阳性溶液,不要引入气泡。

11. 所剩的阳极溶液加入上槽,用缓冲液覆盖所有的管子。

3 IEF 电泳

电泳应分段升高以按下表获得 Vh (电压×小时)乘积为 1841

电压( V

时间(分钟)

100

75

200

75

400

75

600

75

800

10

1000

5

凝胶平衡

1. 融解平衡溶液(在 IEF 结束前 1 小时)。使用之前,在 20ml 平衡溶液中加入 0.2g DTT

2. IEF 结束后,移去管子中的阳性和阴性溶液。

3. 87 %的甘油溶液覆盖帽( cap )凝胶一侧。

4. 5ml 平衡溶液到 Petri 盘。

5. PP 线挤出凝胶: PP 线从帽凝胶一侧插入,管子加样一侧浸入去离子水,小心地向下挤出凝胶。与此同时可看到水中的覆盖液的溶解。凝胶被拉出 5min 后,用水迅速清洗挤压端。然后将管子保持在盛有平衡溶液的 Petri- 盘子上,整个凝胶被 PP 线拉到盘子里。每个盘子里可平衡两块胶。

6. 室温振荡平衡凝胶 10 分钟整。

7. IEF 之后,如果凝胶并不立刻使用,应倒出平衡缓冲液,并在 Petri 盘中- 70 ℃保存。- 20 ℃保存导致分辨率降低;液氮保存将破坏凝胶。

第二向( SDS PAGE

1 SDS-PAGE 胶的制备

1. 加热琼脂糖溶液至 70 ℃使之液化。

2. 冷却琼脂糖溶液至 40 ℃,保持液态。

3. 喷洒 70 %乙醇清洗玻璃板和隔板,并用 Kimwipes 刷干净。

4. 融解凝胶溶液和 APS

5. 将玻璃板夹入夹紧装置,该夹紧装置放在灌装支架的前面狭槽中,这样旋钮对着支架,而“尖角”向上。充分旋转旋钮以使厚的有机玻璃正好对齐后部边缘。这时大玻璃板可以放在有机玻璃板的前面,隔板沿着左边和右边的边缘。插入小板,用拇指轻压玻璃板和隔板以确使玻璃板位于底部。用钳子夹紧做好的“三明治”,后部边缘出现 Newton 环说明旋钮已经非常紧了。不要将旋钮旋得过于紧,否则玻璃板会被夹碎。将三明治从支架抽出,用拇指检查玻璃板和隔板是否与底部齐平。

6. 在小玻璃板底部起 6.9cm 处做标记,做为加样得辅助(凝胶长度为 6.6cm )。

7. 将凝胶“三明治”装置夹到灌装支架上,旋钮向内,“尖角”向上。在有机玻璃板上加压以使凝胶三明治插入小突起下面。

8. 18ml 凝胶溶液和 1.2ml APS 相混合,不要有气泡。溶液必须混匀,不要引进氧气。

9. 含有凝胶溶液得容器放在加样槽的后面玻璃板上,这样凝胶溶液可以沿着加样槽从玻璃板流下而没有气泡,分离胶被加到标记处。

10. 迅速用去离子水覆盖凝胶溶液,以利于聚合并使表面平坦。在凝胶一端用一巴斯德移液管防止搅动凝胶溶液,并使水在凝胶表面均匀地分层。 60 分钟后,凝胶可以用于 SDS-PAGE 电泳。

2 )加样

1. 用滤纸条去除凝胶表面的去离子水。

2. 将凝胶“三明治”放到电极装置上(旋钮冲外,尖角向上):首先将凝胶“三明治”放到电极装置的上面部分,向电极装置挤压它使下面一部分固定。

3. 在平板凝胶表面加 IEF 凝胶:从平衡缓冲液中取出凝胶条,纵向放到厚有机玻璃板的边缘,尽量使凝胶条与加样槽的边缘靠近。使用小刮勺,将凝胶条轻轻向下推,使之小心的滑入加样槽。凝胶条必须位于 SDS-PAGE 的表面,没有气泡。

4. 使用 Pasteur 移液管,将加样槽加满 40 ℃的琼脂糖溶液(没有气泡), 2 分钟后,琼脂糖溶液应凝固。

5. 在电极装置装入凝胶“三明治”以后,将 BioRad 槽注入 620ml 电极溶液,加溶液的时候避免泡沫和气泡的形成。内槽中电极缓冲液面应到达电极装置中红塑料点的位置。

3 SDS PAGE 电泳

1. 在将槽封闭之前,需要确定有机玻璃表面是否干燥,以避免形成“渐进”电流,凝胶表面必须覆盖电极缓冲液。

2. 电压必须如下表所示分段升高,电流和功率要调到电源的最大值。电流值如表所述并在每一部内逐渐减小。在给定的时间间隔初始和结束的数值如下表所示:

电压

时间

一个槽中的电流

2 块胶)

两个平行槽中的电流

4 块胶)

35V

5 分钟

22 21mA

44 42mA

55V

10 分钟

33 32mA

66 64mA

100V

15 分钟

59 48mA

118 96mA

150V

60 分钟

72 50mA

144 100mA

3. SDS-PAGE 结束之后,倒出电极缓冲液,从电极装置中取出凝胶“三明治”。轻微地弯曲隔板,将小玻璃板拉开以取出凝胶。凝胶可以转移到固定溶液中。

4. 固定之后,可以采用几种染色方法。

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