（原创）蛋白质的双向电泳实验方法 （请加分）

蛋白质的双向电泳实验方法

第一向（等电点聚焦，IEF）

1）凝胶条的准备

1．以帽凝胶端（2个校准环：4mm和10mm）朝下，将4根玻璃管插入两个凝胶灌注装置的每个托架中，这样玻璃管恰好站在两个分隔室之一的“充填船”上。从玻璃管顶端到玻璃管底端拉入PP线（小心，线不易移动），否则以后将不能用它们将胶溶液拉上来。

2．溶解分离胶溶液和过硫酸铵溶液。必须监控凝胶溶液的温度，因为高温下（大于25℃）聚合作用太快。

3．分离胶溶液除气4分钟，在桌子边缘轻弹玻璃管壁，避免产生气泡。

4．融化帽凝胶溶液，除气，步骤同3。

5．用Gilson移液管加35μl APS到1365μl分离胶溶液中，溶液应小心摇晃，避免氧气进入胶内。

6．将分离胶溶液加到两个凝胶灌注装置的每一个充填船里（每4个管700μl）。所有的玻璃管末端都必须浸没于凝胶溶液中。

7．小心将PP线抽出，将凝胶溶液拉上至23mm的标记。

8．换充填船分隔室。

9．使用一个Gilson移液管，加10μl 0.8％ APS到390μl帽凝胶溶液中，轻轻振荡使之混匀。

10． 在两个凝胶灌注装置的每个充填船中的空余分隔室内加入200μl帽凝胶溶液；凝胶溶液应到达17mm的标记。

11． 移去充填船，允许凝胶溶液到达13mm的标记。经过这一步，有空气进入管子底端和4mm标记处。

12． 聚合30分钟后，将PP线抽出，去除凝胶表面未聚合的溶液。在毛细血管口部滴加一大滴去离子水，这样在凝胶的上边形成一个潮湿的室，在凝胶和水滴之间形成一个气泡。用此方法形成一个潮湿的室，随后用Parafilm膜封上帽凝胶一侧。凝胶在室温过夜，可以使之进一步聚合。

制备好的管子如果保存于室温，可以在第二天使用，或最迟在制备好第五天使用。

2）加样

1．将乙二胺加入阴极溶液，除气5min，下槽装阴极溶液。

2．融解Sephadex溶液，加入108mg尿素和10μl两性电解混合液到100mg Sephadex胶中，在涡旋器上充分振荡10～15分钟。

3．从凝胶灌注装置移走凝胶管，把它们插入聚焦槽的阳极部分，仍应看到13mm标记。帽凝胶一端朝上。

4．将阴极溶液加入管子的阴极一边，不要有气泡（事先已除去水）。

5．将聚焦槽的阳极部分安放到聚焦槽的底部，管子必须浸入阴极溶液。

6．除去水，并将加样侧干燥。使用一个伸长的巴斯德移液管或凝胶装填移液管头将水吸去，然后用滤纸条将凝胶表面干燥。

7．融解准备好的样品和覆盖溶液。

8．用凝胶装填移液管头，迅速在胶上覆盖大约2mm厚的Sephadex。

9．用一个凝胶装填移液管头，装入样品（1～15μl），加到Sephadex表面。加样时，尖端必须接触Sephdex表层，样品应小心加入，避免气泡。

10． 使用凝胶装填头，轻轻在样品上加入5μl覆盖液并分层，不要使覆盖液和样品相混合。然后在毛细血管中加入阳性溶液，不要引入气泡。

11． 所剩的阳极溶液加入上槽，用缓冲液覆盖所有的管子。

3）IEF电泳

电泳应分段升高以按下表获得Vh（电压×小时）乘积为1841：

凝胶平衡

1．融解平衡溶液（在IEF结束前1小时）。使用之前，在20ml平衡溶液中加入0.2g DTT。

2．IEF结束后，移去管子中的阳性和阴性溶液。

3．用87％的甘油溶液覆盖帽（cap）凝胶一侧。

4．加5ml平衡溶液到Petri盘。

5．用PP线挤出凝胶：PP线从帽凝胶一侧插入，管子加样一侧浸入去离子水，小心地向下挤出凝胶。与此同时可看到水中的覆盖液的溶解。凝胶被拉出5min后，用水迅速清洗挤压端。然后将管子保持在盛有平衡溶液的Petri-盘子上，整个凝胶被PP线拉到盘子里。每个盘子里可平衡两块胶。

6．室温振荡平衡凝胶10分钟整。

7．IEF之后，如果凝胶并不立刻使用，应倒出平衡缓冲液，并在Petri盘中－70℃保存。－20℃保存导致分辨率降低；液氮保存将破坏凝胶。

第二向（SDS－PAGE）

1）SDS-PAGE胶的制备

1．加热琼脂糖溶液至70℃使之液化。

2．冷却琼脂糖溶液至40℃，保持液态。

3．喷洒70％乙醇清洗玻璃板和隔板，并用Kimwipes刷干净。

4．融解凝胶溶液和APS。

5．将玻璃板夹入夹紧装置，该夹紧装置放在灌装支架的前面狭槽中，这样旋钮对着支架，而“尖角”向上。充分旋转旋钮以使厚的有机玻璃正好对齐后部边缘。这时大玻璃板可以放在有机玻璃板的前面，隔板沿着左边和右边的边缘。

插入小板，用拇指轻压玻璃板和隔板以确使玻璃板位于底部。用钳子夹紧做好的“三明治”，后部边缘出现Newton环说明旋钮已经非常紧了。不要将旋钮旋得过于紧，否则玻璃板会被夹碎。将三明治从支架抽出，用拇指检查玻璃板和隔板是否与底部齐平。

6．在小玻璃板底部起6.9cm处做标记，做为加样得辅助（凝胶长度为6.6cm）。

7．将凝胶“三明治”装置夹到灌装支架上，旋钮向内，“尖角”向上。在有机玻璃板上加压以使凝胶三明治插入小突起下面。

8．将18ml凝胶溶液和1.2ml APS相混合，不要有气泡。溶液必须混匀，不要引进氧气。

9．含有凝胶溶液得容器放在加样槽的后面玻璃板上，这样凝胶溶液可以沿着加样槽从玻璃板流下而没有气泡，分离胶被加到标记处。

10． 迅速用去离子水覆盖凝胶溶液，以利于聚合并使表面平坦。在凝胶一端用一巴斯德移液管防止搅动凝胶溶液，并使水在凝胶表面均匀地分层。60分钟后，凝胶可以用于SDS-PAGE电泳。

2）加样

1．用滤纸条去除凝胶表面的去离子水。

2．将凝胶“三明治”放到电极装置上（旋钮冲外，尖角向上）：首先将凝胶“三明治”放到电极装置的上面部分，向电极装置挤压它使下面一部分固定。

3．在平板凝胶表面加IEF凝胶：从平衡缓冲液中取出凝胶条，纵向放到厚有机玻璃板的边缘，尽量使凝胶条与加样槽的边缘靠近。使用小刮勺，将凝胶条轻轻向下推，使之小心的滑入加样槽。凝胶条必须位于SDS-PAGE的表面，没有气泡。

4．使用Pasteur移液管，将加样槽加满40℃的琼脂糖溶液（没有气泡），2分钟后，琼脂糖溶液应凝固。

5．在电极装置装入凝胶“三明治”以后，将BioRad槽注入620ml电极溶液，加溶液的时候避免泡沫和气泡的形成。内槽中电极缓冲液面应到达电极装置中红塑料点的位置。

3）SDS－PAGE电泳

1．在将槽封闭之前，需要确定有机玻璃表面是否干燥，以避免形成“渐进”电流，凝胶表面必须覆盖电极缓冲液。

2．电压必须如下表所示分段升高，电流和功率要调到电源的最大值。电流值如表所述并在每一部内逐渐减小。在给定的时间间隔初始和结束的数值如下表所示：

3．SDS-PAGE结束之后，倒出电极缓冲液，从电极装置中取出凝胶“三明治”。轻微地弯曲隔板，将小玻璃板拉开以取出凝胶。凝胶可以转移到固定溶液中。

4．固定之后，可以采用几种染色方法。