【原创,申请加分】 DNA芯片技术
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DNA芯片技术
基因芯片(又称DNA芯片、寡核苷酸芯片等)最早由E. Southern在1989年提出。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。
高度的并行性 可大大提高实验的进程,有利于DNA芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读。
多样性 在单个芯片中可以进行样品的多方面分析,提高了分析的精确性,避免因不同实验条件产生的误差。
微型化 可以减少试剂用量和减小反应液体积,从而提高样品浓度和反应速率。
高度自动化 可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量不易波动。
一个典型的基因芯片实验包括:芯片的准备或购买、靶DNA和探针的准备或标记、标记探针与靶DNA的杂交、芯片扫描和影象信息的数据分析。
一. DNA芯片技术的基本要点
DNA芯片技术包含四个基本要点:DNA方阵的构建、样品的制备、杂交,杂交图谱的检测及读出。
采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。
根据芯片上固定的探针不同,生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片;如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA,就是DNA芯片。
由于基因芯片(Genechip)这一专有名词已经被业界的领头羊Affymetrix公司注册专利,因而其他厂家的同类产品通常称为DNA微阵列(DNA Microarray)。这类产品是目前最重要的一种,有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分,包括二种模式:一是将靶DNA固定于支持物上,适合于大量不同靶DNA的分析,二是将大量探针分子固定于支持物上,适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。
基因芯片上的分子杂交和扫描图像分析患者或者实验受检标本的制备通常要准备待测标本和对照标本。标本是从血液或组织样品得到的DNA/mRNA。mRNA需先制备成cDNA。通常经PCR扩增的方法标记上放射性32P/33P或荧光物质(常用Cy3或/Cy5分别标记),就可加载到基因芯片上进行反应了。如被检测标本的核酸中有与芯片(阵列)上DNA互补的序列存在,则两者氢键相结合。芯片杂交条件由芯片上DNA片段的长短和本身的用途所决定。结合在探针上的被检测标本的核酸量由其碱基构成、靶—探针匹配情况决定。杂交结果用计算机做图像分析和基因定量。荧光标记法标记DNA探针可以用常规设计的激光共聚焦显微镜和光电倍增管检测。同一长度的探针,GC含量高的序列与靶的结合强度高,荧光亮度强;GC含量低则结合强度低。靶_探针完全匹配者结合强度远远高于匹配不完全者或者有一些碱基缺失或插入者。荧光标记法的优点是重复性好,缺点是灵敏度稍低。基因芯片所获得的图像可以通过计算机软件处理,分析和定量。
1.DNA方阵的构建
基因芯片通常要构建DNA探针的阵列,构建的方法可以大致归类为光蚀刻法、喷墨打印法、机械手排列3种。实际上就是将大量已知的探针,固定于选定的片基上,从而获得一个高度(通常探针的密度在65 000~600 000/cm2)的探针阵列。在制作基因芯片时要根据所要测定的基因片断,确定可以与之杂交的探针阵列,并设计出用于合成该阵列的光刻底片,以便进行合成。由此使许多不同的DNA序列片段聚集于一个小的玻璃片基构成DNA方阵。
2.样品DNA或mRNA的制备
血液或活组织的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度。美国Mosaic Technology公司发展的固相PCR系统包含两套引物,每套都从靶基因两头延伸。由于反应是在固相中进行,避免了引物竞争现象,也减少了残留物污染和重复引发。
3.杂交
杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步,其复杂的程度和具体条件的控制由芯片中DNA片段的长短和芯片本身的用途而定。样品经过适当的扩增后,以荧光标记物标记,放入基因芯片自动孵育装置(Fluidics Station)中,由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件进行杂交,这一过程仅需要数秒钟。
影响杂交的因素很多,合适长度的DNA片段可有利于探针与之杂交;DNA分子中任何带正电或负电的残基都会影响杂交效率。另外,在有利于杂交双链形成的条件下,探针分子本身也有利于形成自身双链的二级结构甚至三级结构,使靶序列不易被探测到。
4.杂交图谱的检测和读出
杂交完成后,要对基因芯片进行“读片”,即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜,对基因芯片表面的每个位点进行检测。这种显微镜,将聚焦的平面设定为芯片的表面,因此可以检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记,而待测样品中未与芯片上探针结合的荧光标记物,则悬浮于溶液中,由于不在聚焦平面上,因而不被检测。样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素,但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多,因此,通过对信号强度的分析,就可以区分正确与错误的配对。
为了使结果的检验更加简便和快速,Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站,对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析,仅需要数分钟的时间。
目前DNA探针大多采用荧光标记法,并根据各杂交点的荧光信号强弱用扫描同焦显微镜读出。它的优点是重复性好,缺点是灵敏度相对较低。为此,人们正在研究多种替代方法,如:质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等。最有前途的是质谱法,它可以在各DNA方阵点上提供更多、更快、更精确的信息以供读出。
由于杂交时产生序列重叠,会有成百上千的杂交点出现在图谱上,形成极为复杂的杂交图谱。一般说来,这些图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成,而不是通过对比进行人工读谱。
一块基因芯片相当于一个集成处理器,其中的每个探针相当于一个探头,能对相关及大量信息实现同时、自动和快速的采集、传输、分析和处理,做出相应的检测和诊断。
由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting 和Northern Blotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。
二.DNA芯片技术的应用
1.基因表达分析 基因芯片具有高度的敏感性和特异性,它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同,基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中,包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针,这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。这种成对的探针可以将非特异性杂交和背景讯号减小到最低的水平,由此我们就可以确定那些低强度的mRNA。目前,Affymetrix公司已经生产出HugeneFL、Mu6500(含有小鼠6 500个基因)、Ye6100(含有酵母6 100个基因)等基因芯片成品。
美国Stanford大学的V.R.Iyer等人,对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。在所有被监测的基因中,约有500个基因最为活跃,而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中,最早被活化的是那些转录调控基因。在活化的基因中,有28个基因共同作用,控制细胞的增殖;8个与免疫反应的激活有关;19个与血管重建有关;另有许多基因,与血管新生密切相关。在肿瘤细胞中,基因的表达与正常的细胞存在着明显的差异。利用基因芯片对表达进行分析,在一次试验中可以获取相当于在60余万次传统的Northern杂交中所获得的关于基因表达的信息。通过这种实验方法,可以建立一种全新的肿瘤分类学方法,即依据每个肿瘤细胞中的基因表达情况对肿瘤细胞进行分类。
2.基因型和多态性分析 在同一物种不同种群和个体之间,有着多种不同的基因型,而这种不同,往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较,就可以得出基因与性状的关系。但是,由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的,分析起来十分困难,基因芯片技术恰恰解决了这一问题,利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性,我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。
3.疾病的诊断与治疗
基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。
人类恶性肿瘤中,约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关,目前研究人员已经研制成功了可以检测p53基因所有编码区(外显子2~外显子11)错义突变和单碱基缺失突变的基因芯片。以外显子7的第248个密码子为例,野生型为CGG,在芯片上做出5条探针,相应位点分别为GAC、GCC、GGC、GTC和G-C,根据杂交后的荧光显色图,就可以分析出该位点为何种突变。HIV是严重危害人类健康的一种病毒,近年来随着其迅速的蔓延,受到了越来越多的重视。而HIV-I在病人体内的突变,对治疗起着重大的影响。早在1996年,M.J.Kozal等就利用基因芯片,对HIV-I B亚型中的蛋白酶基因的多态性进行了分析,这也是基因芯片技术被首次应用于临床实践。在艾滋病的治疗中,使用HIV蛋白酶抑制剂是一种重要的手段。然而,病毒对该药物的反应却有着很大的差异。利用基因芯片技术,研究人员分析了取自102个病人的167个病毒单体,发现这些同为美国HIV-I B亚种的病毒的基因序列存在极大差异,其中蛋白酶的基因片断差异最大,在编码99个氨基酸的序列中,竟有47.5%存在明显突变。这些氨基酸的突变,直接导致了病毒抗药性的不同。
临床应用
1) 遗传病的检测
1997年Affymetrix公司和美国麻省的 研究所合作确定了450个SNP(单核苷酸多态性),将标志收入单个基因芯片用来扫描各个个体基因组成上的差异,这对研究亲代与子代遗传中的重组有重要的价值,并有望创造出更精确的第三代遗传图。
2) 艾滋病的检测
1996年底Kazal等与 Affymetrix公司合作研制一种基因芯片,对HIV-1 逆转录酶及蛋白酶基因突变筛查,检查结果达到98%;并可以跟踪检测艾滋病病毒拮抗药物产生的突变,疾病相关基因型突变及监控病人在治疗中的反应。Hauser等应用基因芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应之前,检测艾滋病病毒,对艾滋病早期诊断十分重要。
3) 血液疾病的检测
1997年,Affymetrix 公司开始将基因芯片技术用于诊断地中海贫血,检测β-珠蛋白基因的突变,适用于大面积病人的筛查,具有高准确性、高自动化的特点。基因芯片探针以绿色荧光标记,目的基因转录产物即靶分子标记红色荧光,完全杂交的分子产生黄色荧光信号,突变可通过分析两种荧光强度的对比度区分出来。
4)肝炎病毒的检测
国内博道公司已研制了检测丙型肝炎病毒(HCV)的基因芯片,选取40个HCV 基因作为探针制备微阵列,对13个丙型肝炎病人血清和12个正常人血清标本进行检测,结果准确率达
100%。东南大学吴健雄实验室正在进行病毒性肝炎诊断芯片的研制,预计可以对不同类型和亚型的肝炎进行鉴别和诊断。
肿瘤检测研究及抗肿瘤药物筛选
1)肿瘤检测研究
美国Stanford 大学的Botstein 利用cDNA 微阵列芯片,对乳腺癌细胞的基因表达进行了分析,发现其基因表达水平明显低于正常细胞。Hacin 等将基因芯片应用于双色突变分析,他们的分析对象是与人类遗传性乳腺癌和卵巢癌密切相关的BRCA1 基因的外显子11。在扩增后,将BRCA1 基因的外显子11 置于含有荧光素-12-UTP 的环境中进行体外转录反应,而后将转录产生的mRNA 与 BRCA1 外显子11 芯片杂交,4 小时后,用藻红蛋白染色。在观察时,用488nm 的氩离子激光进行扫描,荧光染色位点呈现绿色,而藻红蛋白染色的位点呈现红色。应用双色分析,可以更为清楚地监测未知标本与标准链之间的竞争性杂交情况,进而分析该基因中的不同突变。通过对15 名病人BRCA1 基因观察,有14 名病人在外显子11 位点存在不同的突变。Wang 用cDNA 微阵列监测卵巢癌的基因表达全貌的改变,研究了5766 人,包括正常卵巢组织和卵巢癌组织具有不同的基因表达;分析微阵列杂交结果,对卵巢癌的诊断和干预可以提供新的线索。检测原发性肺癌,用寡核苷酸探针阵列快速测序p53;结果发现基因芯片p53 测定是一种检测 p53 突变的快速、适当、准确的方法。
2) 抗肿瘤药物筛选
美国国立癌症研究所在癌症治疗发展计划中观察了65000 种以上化合物对9 种肿瘤组织来源的60 个肿瘤细胞系的作用效应,所得数据为癌症药物的开发和研究提供了很有价值的参考作用,在此基础上,肿瘤生物学家利用基因芯片评估药物对肿瘤治疗的可行性。Scherf 用含 10000 个基因芯片对60 个肿瘤细胞系的基因表达谱进行分析,获得一系列标准曲线,发现大部分细胞系保留了其原代分离组织的特征基因表达;又进一步评价122 种药物对这些细胞系基因表达的影响,从中筛选出抗肿瘤药物候选化合物,并对其作临床药效评价。
PCR基因芯片
随着微加工技术的发展,我们建立了有1200个微反应池的PCR 基因芯片,将基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)技术结合在一起。PCR 基因芯片综合了基因芯片体积小却可以检测大量基因,以及PCR 敏感而且容易发现各种基因变异的特点,采用以PCR 为基础,而非以分子杂交为基础的检测方式,克服了杂交技术所存在的内在缺陷,大大增强了实验的敏感性和可重复性;扩展了基因芯片在生物医学领域中应用的范围,更适用于各种基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定。PCR 反应采用荧光探针作实时定量分析。在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面会有广泛应用前景。
基因芯片(又称DNA芯片、寡核苷酸芯片等)最早由E. Southern在1989年提出。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。
高度的并行性 可大大提高实验的进程,有利于DNA芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读。
多样性 在单个芯片中可以进行样品的多方面分析,提高了分析的精确性,避免因不同实验条件产生的误差。
微型化 可以减少试剂用量和减小反应液体积,从而提高样品浓度和反应速率。
高度自动化 可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量不易波动。
一个典型的基因芯片实验包括:芯片的准备或购买、靶DNA和探针的准备或标记、标记探针与靶DNA的杂交、芯片扫描和影象信息的数据分析。
一. DNA芯片技术的基本要点
DNA芯片技术包含四个基本要点:DNA方阵的构建、样品的制备、杂交,杂交图谱的检测及读出。
采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。
根据芯片上固定的探针不同,生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片;如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA,就是DNA芯片。
由于基因芯片(Genechip)这一专有名词已经被业界的领头羊Affymetrix公司注册专利,因而其他厂家的同类产品通常称为DNA微阵列(DNA Microarray)。这类产品是目前最重要的一种,有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分,包括二种模式:一是将靶DNA固定于支持物上,适合于大量不同靶DNA的分析,二是将大量探针分子固定于支持物上,适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。
基因芯片上的分子杂交和扫描图像分析患者或者实验受检标本的制备通常要准备待测标本和对照标本。标本是从血液或组织样品得到的DNA/mRNA。mRNA需先制备成cDNA。通常经PCR扩增的方法标记上放射性32P/33P或荧光物质(常用Cy3或/Cy5分别标记),就可加载到基因芯片上进行反应了。如被检测标本的核酸中有与芯片(阵列)上DNA互补的序列存在,则两者氢键相结合。芯片杂交条件由芯片上DNA片段的长短和本身的用途所决定。结合在探针上的被检测标本的核酸量由其碱基构成、靶—探针匹配情况决定。杂交结果用计算机做图像分析和基因定量。荧光标记法标记DNA探针可以用常规设计的激光共聚焦显微镜和光电倍增管检测。同一长度的探针,GC含量高的序列与靶的结合强度高,荧光亮度强;GC含量低则结合强度低。靶_探针完全匹配者结合强度远远高于匹配不完全者或者有一些碱基缺失或插入者。荧光标记法的优点是重复性好,缺点是灵敏度稍低。基因芯片所获得的图像可以通过计算机软件处理,分析和定量。
1.DNA方阵的构建
基因芯片通常要构建DNA探针的阵列,构建的方法可以大致归类为光蚀刻法、喷墨打印法、机械手排列3种。实际上就是将大量已知的探针,固定于选定的片基上,从而获得一个高度(通常探针的密度在65 000~600 000/cm2)的探针阵列。在制作基因芯片时要根据所要测定的基因片断,确定可以与之杂交的探针阵列,并设计出用于合成该阵列的光刻底片,以便进行合成。由此使许多不同的DNA序列片段聚集于一个小的玻璃片基构成DNA方阵。
2.样品DNA或mRNA的制备
血液或活组织的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度。美国Mosaic Technology公司发展的固相PCR系统包含两套引物,每套都从靶基因两头延伸。由于反应是在固相中进行,避免了引物竞争现象,也减少了残留物污染和重复引发。
3.杂交
杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步,其复杂的程度和具体条件的控制由芯片中DNA片段的长短和芯片本身的用途而定。样品经过适当的扩增后,以荧光标记物标记,放入基因芯片自动孵育装置(Fluidics Station)中,由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件进行杂交,这一过程仅需要数秒钟。
影响杂交的因素很多,合适长度的DNA片段可有利于探针与之杂交;DNA分子中任何带正电或负电的残基都会影响杂交效率。另外,在有利于杂交双链形成的条件下,探针分子本身也有利于形成自身双链的二级结构甚至三级结构,使靶序列不易被探测到。
4.杂交图谱的检测和读出
杂交完成后,要对基因芯片进行“读片”,即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜,对基因芯片表面的每个位点进行检测。这种显微镜,将聚焦的平面设定为芯片的表面,因此可以检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记,而待测样品中未与芯片上探针结合的荧光标记物,则悬浮于溶液中,由于不在聚焦平面上,因而不被检测。样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素,但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多,因此,通过对信号强度的分析,就可以区分正确与错误的配对。
为了使结果的检验更加简便和快速,Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站,对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析,仅需要数分钟的时间。
目前DNA探针大多采用荧光标记法,并根据各杂交点的荧光信号强弱用扫描同焦显微镜读出。它的优点是重复性好,缺点是灵敏度相对较低。为此,人们正在研究多种替代方法,如:质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等。最有前途的是质谱法,它可以在各DNA方阵点上提供更多、更快、更精确的信息以供读出。
由于杂交时产生序列重叠,会有成百上千的杂交点出现在图谱上,形成极为复杂的杂交图谱。一般说来,这些图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成,而不是通过对比进行人工读谱。
一块基因芯片相当于一个集成处理器,其中的每个探针相当于一个探头,能对相关及大量信息实现同时、自动和快速的采集、传输、分析和处理,做出相应的检测和诊断。
由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting 和Northern Blotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。
二.DNA芯片技术的应用
1.基因表达分析 基因芯片具有高度的敏感性和特异性,它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同,基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中,包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针,这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。这种成对的探针可以将非特异性杂交和背景讯号减小到最低的水平,由此我们就可以确定那些低强度的mRNA。目前,Affymetrix公司已经生产出HugeneFL、Mu6500(含有小鼠6 500个基因)、Ye6100(含有酵母6 100个基因)等基因芯片成品。
美国Stanford大学的V.R.Iyer等人,对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的基因进行了分析。在所有被监测的基因中,约有500个基因最为活跃,而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中,最早被活化的是那些转录调控基因。在活化的基因中,有28个基因共同作用,控制细胞的增殖;8个与免疫反应的激活有关;19个与血管重建有关;另有许多基因,与血管新生密切相关。在肿瘤细胞中,基因的表达与正常的细胞存在着明显的差异。利用基因芯片对表达进行分析,在一次试验中可以获取相当于在60余万次传统的Northern杂交中所获得的关于基因表达的信息。通过这种实验方法,可以建立一种全新的肿瘤分类学方法,即依据每个肿瘤细胞中的基因表达情况对肿瘤细胞进行分类。
2.基因型和多态性分析 在同一物种不同种群和个体之间,有着多种不同的基因型,而这种不同,往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较,就可以得出基因与性状的关系。但是,由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的,分析起来十分困难,基因芯片技术恰恰解决了这一问题,利用其可以同时反应数千甚至更多个基因的特性,我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。
3.疾病的诊断与治疗
基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤和药物代谢等方面的研究。
人类恶性肿瘤中,约有60%与人类p53抑癌基因的突变有关,目前研究人员已经研制成功了可以检测p53基因所有编码区(外显子2~外显子11)错义突变和单碱基缺失突变的基因芯片。以外显子7的第248个密码子为例,野生型为CGG,在芯片上做出5条探针,相应位点分别为GAC、GCC、GGC、GTC和G-C,根据杂交后的荧光显色图,就可以分析出该位点为何种突变。HIV是严重危害人类健康的一种病毒,近年来随着其迅速的蔓延,受到了越来越多的重视。而HIV-I在病人体内的突变,对治疗起着重大的影响。早在1996年,M.J.Kozal等就利用基因芯片,对HIV-I B亚型中的蛋白酶基因的多态性进行了分析,这也是基因芯片技术被首次应用于临床实践。在艾滋病的治疗中,使用HIV蛋白酶抑制剂是一种重要的手段。然而,病毒对该药物的反应却有着很大的差异。利用基因芯片技术,研究人员分析了取自102个病人的167个病毒单体,发现这些同为美国HIV-I B亚种的病毒的基因序列存在极大差异,其中蛋白酶的基因片断差异最大,在编码99个氨基酸的序列中,竟有47.5%存在明显突变。这些氨基酸的突变,直接导致了病毒抗药性的不同。
临床应用
1) 遗传病的检测
1997年Affymetrix公司和美国麻省的 研究所合作确定了450个SNP(单核苷酸多态性),将标志收入单个基因芯片用来扫描各个个体基因组成上的差异,这对研究亲代与子代遗传中的重组有重要的价值,并有望创造出更精确的第三代遗传图。
2) 艾滋病的检测
1996年底Kazal等与 Affymetrix公司合作研制一种基因芯片,对HIV-1 逆转录酶及蛋白酶基因突变筛查,检查结果达到98%;并可以跟踪检测艾滋病病毒拮抗药物产生的突变,疾病相关基因型突变及监控病人在治疗中的反应。Hauser等应用基因芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应之前,检测艾滋病病毒,对艾滋病早期诊断十分重要。
3) 血液疾病的检测
1997年,Affymetrix 公司开始将基因芯片技术用于诊断地中海贫血,检测β-珠蛋白基因的突变,适用于大面积病人的筛查,具有高准确性、高自动化的特点。基因芯片探针以绿色荧光标记,目的基因转录产物即靶分子标记红色荧光,完全杂交的分子产生黄色荧光信号,突变可通过分析两种荧光强度的对比度区分出来。
4)肝炎病毒的检测
国内博道公司已研制了检测丙型肝炎病毒(HCV)的基因芯片,选取40个HCV 基因作为探针制备微阵列,对13个丙型肝炎病人血清和12个正常人血清标本进行检测,结果准确率达
100%。东南大学吴健雄实验室正在进行病毒性肝炎诊断芯片的研制,预计可以对不同类型和亚型的肝炎进行鉴别和诊断。
肿瘤检测研究及抗肿瘤药物筛选
1)肿瘤检测研究
美国Stanford 大学的Botstein 利用cDNA 微阵列芯片,对乳腺癌细胞的基因表达进行了分析,发现其基因表达水平明显低于正常细胞。Hacin 等将基因芯片应用于双色突变分析,他们的分析对象是与人类遗传性乳腺癌和卵巢癌密切相关的BRCA1 基因的外显子11。在扩增后,将BRCA1 基因的外显子11 置于含有荧光素-12-UTP 的环境中进行体外转录反应,而后将转录产生的mRNA 与 BRCA1 外显子11 芯片杂交,4 小时后,用藻红蛋白染色。在观察时,用488nm 的氩离子激光进行扫描,荧光染色位点呈现绿色,而藻红蛋白染色的位点呈现红色。应用双色分析,可以更为清楚地监测未知标本与标准链之间的竞争性杂交情况,进而分析该基因中的不同突变。通过对15 名病人BRCA1 基因观察,有14 名病人在外显子11 位点存在不同的突变。Wang 用cDNA 微阵列监测卵巢癌的基因表达全貌的改变,研究了5766 人,包括正常卵巢组织和卵巢癌组织具有不同的基因表达;分析微阵列杂交结果,对卵巢癌的诊断和干预可以提供新的线索。检测原发性肺癌,用寡核苷酸探针阵列快速测序p53;结果发现基因芯片p53 测定是一种检测 p53 突变的快速、适当、准确的方法。
2) 抗肿瘤药物筛选
美国国立癌症研究所在癌症治疗发展计划中观察了65000 种以上化合物对9 种肿瘤组织来源的60 个肿瘤细胞系的作用效应,所得数据为癌症药物的开发和研究提供了很有价值的参考作用,在此基础上,肿瘤生物学家利用基因芯片评估药物对肿瘤治疗的可行性。Scherf 用含 10000 个基因芯片对60 个肿瘤细胞系的基因表达谱进行分析,获得一系列标准曲线,发现大部分细胞系保留了其原代分离组织的特征基因表达;又进一步评价122 种药物对这些细胞系基因表达的影响,从中筛选出抗肿瘤药物候选化合物,并对其作临床药效评价。
PCR基因芯片
随着微加工技术的发展,我们建立了有1200个微反应池的PCR 基因芯片,将基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)技术结合在一起。PCR 基因芯片综合了基因芯片体积小却可以检测大量基因,以及PCR 敏感而且容易发现各种基因变异的特点,采用以PCR 为基础,而非以分子杂交为基础的检测方式,克服了杂交技术所存在的内在缺陷,大大增强了实验的敏感性和可重复性;扩展了基因芯片在生物医学领域中应用的范围,更适用于各种基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定。PCR 反应采用荧光探针作实时定量分析。在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面会有广泛应用前景。