胚胎中细胞基因打靶方法

胚胎中细胞基因打靶方法

置换型设计物的制备

1． 选择靶基因的一个部分作为设计物的组成，还包括有靶基因的另一个部分作为 Southern 杂交探针，以鉴定细胞中是否已发生同源重组之用。

2． 在质粒载体中构建一个克隆； neo 基因能阻断靶基因的表达，在 neo 的两侧保持保留同源区；在同源区外的置换型设计物中包含一个胸腺嘧啶激酶（ TK ）基因。

3． 用限制性内切酶消化设计物 DNA 使成线形；设计物 DNA 线形化后，质粒 DNA 仍附于在 TK 基因上。如果设计物在基因组发生随机插入中出现任何 DNA 序列丢失时，线性态有助于保持 TK 基因的活性。

4． 用酚 / 氯仿抽提设计物 DNA 。

5． 用加两个体积的 95 ％乙醇沉淀，微型离心机离心 30 秒，去上清，使沉淀物干燥到仍保持微湿润状态。

6． 把沉淀物溶于 100 μ l 水中，检测是否已被彻底消化，在凝胶电泳中测定 DNA 的浓度。

转染设计物和 ES 细胞的选择

7． 把细胞培养在 ES/LIF 培养基中；每 2 ～ 3 天传代细胞，把细胞接种到 100mm 凝胶培养皿上，每皿 1 ～ 2 × 10⁶ 细胞。

8． 用胰蛋白酶 /EDTA 消化收集细胞达 5 × 10⁶ ～ 1 × 10⁷ ；消化 5 分钟，令细胞完全脱壁，用吸管吹打使分散成单细胞，加 5ml ES 培养液，用 1ml 电击液重悬于同一管中。

9． 加 1 pmol 消毒线性 DNA 。

10． 450V ， 250 μ F 在 4mm 电击小室中进行电击；室温中培养 10 分钟。

11． 把 ES 细胞培养在 ES 培养液中，按 1 ～ 2 × 10⁶ 细胞 /100mm 凝胶培养皿上，培养 24 小时。

12． 更换入含有 G418 （ 2mg/ml 终浓度）和 GANC （ 2 μ M 终浓度）的 ES/LIF 培养液中，进行筛选。

13． 继续培养，每日更换一次 ES/LIF 培养液和加有 G418 （ 2mg/ml 终浓度）及 GANC （ 2 μ M 终浓度），继续筛选直到单个、分离的克隆出现为止（典型情况下，电击后 1 周内出现）；用一个高压消毒过的吸管从培养皿中分离出单个克隆，置入 35 μ l 胰蛋白酶 /EDTA 液中消化 5 分钟；反复吹打 5 次分散细胞，把细胞转入铺有凝胶和每孔含有 1ml ES/LIF 培养液 24 孔培养板中。

14． 培养至克隆出现，但细胞无分化（ 3 ～ 4 天）；半数细胞传代铺有凝胶 24 孔板中监视，把剩余的细胞加入到 0.5ml 冻存培养液中，－ 70 ℃过夜，次日转入液氮中。

15． 监视 ES 细胞，在 24 孔培养板中培养至接近汇合（通常 2 ～ 3 天）；在此阶段中对防止 ES 细胞发生分化并非十分严格，在培养液中也可不加 LIF ，但在 LIF 存在情况下，利于对细胞的生长。

16． 加 300 μ l 消化缓冲液，转入 1.5 μ l 微型离心管中，在 55 ℃中培养过夜。

17． 加 150 μ l 饱和 NaCl ，强烈旋转。加 2 体积的 95 ％乙醇。有一些学者用两体积的乙醇沉淀 DNA 但不加盐。

18． 把 DNA 沉淀重悬入 50 μ l 水中， OD₂₆₀ 吸收值测 DNA 浓度。

19． 消化 10 μ g DNA ，再加适当内切酶酶解。

20． 把消化的 DNA 走 1 ％琼脂糖凝胶电泳，把不同长度的 DNA 片段分离开，转移到尼龙膜上，做 Southern 吸印转移，选用从步骤 1 中的探针进行杂交，把无改变的靶基因，从已发生同源重组的靶基因中区分出来。

21． 筛选 ES 细胞，显示有两个近于相同强度的杂交片段；一个应为无改变的靶基因，另个应为发生同源重组的靶基因。如果两个片段显示呈现不同杂交强度，则细胞群可能不是克隆群。细胞冻存于液氮中。