简介
冻存（cryopreservation）是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于-196℃ 液氮中低温保存，可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来，这样在需要的时候再复苏用于实验。适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢，可以防止因意外事件而造成丢种，起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。除此之外，还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。
原理
冻存技术的原理是加入保护剂，如终浓度 5％～15％ 的甘油或二甲亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用「慢冻快融」的方法能较好地保证胚胎、配子或卵巢的存活。
材料与仪器
器材：
① 冻存管
② GLT
③ 超低温冰箱
试剂：
① 材料：猪胚胎
② 冷冻液 I（TCM199 ＋ 20％ FCS ＋ 10％ EG ＋ 10％ DMSO）
③ 冷冻液 II（TCM199 ＋ 20％ FCS ＋ 20％ EG ＋ 20％ DMSO ＋ 0.4 mol/L sucrose）
④ 液氮
⑤ 解冻液（TCM199 ＋ 20％ FCS）
⑥ 0.13 mol/LSUC
⑦ 0.075 mol/L suerose
步骤
猪胚胎冻存及解冻的基本过程可分为如下几步：
1. 胚胎冷冻的操作均在室温下进行。胚胎先在冷冻液 I（TCM199 ＋ 20％ FCS ＋ 10％ EG ＋ 10％ DMSO）中孵育 3 分钟，然后胚胎立即转入冷冻液 II（TCM199 ＋ 20％ FCS ＋ 20％ EG ＋ 20％ DMSO ＋ 0.4 mol/L sucrose）中孵育 1 分钟，在这 1 分钟里，要尽快将胚胎吸入 GLT 的细端最后，将胚胎投入液氮。
2. 解冻液的温度均为 37 ℃，解冻液的基础液均为 TCM199 ＋ 20％ FCS。解冻时，将 GLT 的细端浸入 0.13 mol/L SUC 溶液，1 分钟后，将胚胎转移到相同的蔗糖溶液中孵育 5 分钟，接下来将胚胎转入 0.075 mol/L suerose 溶液中孵育 5 分钟，最后将胚胎保存在 37 ℃，5％ CO2、饱和湿度下的基础液中等待移植。
来源：丁香实验
