简介
冻存（cryopreservation）是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于 -196 ℃ 液氮中低温保存，可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来，这样在需要的时候再复苏用于实验。适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢，可以防止因意外事件而造成丢种，起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。除此之外，还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。
原理
冻存技术的原理是加入保护剂，如终浓度 5％～15％ 的甘油或二甲亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用「慢冻快融」的方法能较好地保证胚胎、配子或卵巢的存活。
材料与仪器
器材：
① 冻存管
② 无菌移液枪、枪头
③ 超低温冰箱
④ CO2、37 ℃ 恒温箱
⑤ 纱布、转子、剪子和镊子（2 把）
⑥ 温度计、离心管座、冰袋、2 L 烧杯、干冰及鲜鸡蛋
试剂：
① 材料：猪
② Tes、Tris、PBS
③ 葡萄糖、卵黄、十二烷基硫酸钠（SDS）
④ 液氮
⑤ 甘油
⑥ 精子洗涤液
⑦ 冻液 I 液、冻液 II 液
步骤
猪精子冻存的基本过程可分为如下几步：
1．鲜精采集
用手握法采集精液，40 ℃ 水浴带回实验室，选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在 80％ 以上，密度为「密」的精液用于实验。
2．精液稀释
（1）精液预处理：新鲜精液经品质评定合格后，用 4 层纱布进行过滤，过滤后的液体按 1:1 比例加入洗涤液进行洗涤，加液体时一定让液体顺着管壁流下去，不可直接冲到精液上，以免精子的损伤，随后进行离心（1000 g．5 分钟），去上清。
（2）冻液 I 液稀释和平衡：在精液完成预处理后，按照 1:1-1:2 的比例立即用冷冻液 1 液进行稀释，用枪头轻轻混匀，放入 4 ℃ 水浴（水不宜过多，以 600 ml 为宜，烧杯放到 4 ℃ 冰箱里，烧杯底部放冰块，在 4 ℃ 冰箱里平衡 90 分钟，使其降至 4 ℃）中降温。
（3）冷冻液 II 液稀释和平衡：将经过第一次稀释和平衡的精液在冰箱内按 1:1 比例用等温 II 液稀释，充分混匀后继续放到冰箱中平衡 5 分钟。
3. 精液冷冻 平衡好的精液滴冻到干冰上，每滴 100 μl，滴冻 1 分钟，随后装入扎眼的离心管中，最后将冷冻的颗粒浸入液氮内。
4. 精液解冻 采用湿解冻法解冻，以 BTS 液为解冻液。42 ℃ 水浴，解冻后 1000 g，5 分钟重复离心两次．用 DPBS 重新悬浮，镜检。
来源：丁香实验
