分子标记

内容：
一、遗传标记
二、DNA分子标记
三、染色体原位杂交
四、DNA分子标记的应用

长期以来，植物育种中选择都是基于植株的表型性状进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但水稻的许多重要农艺性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。遗传育种家们很早就提出了利用标记进行辅助选择以加速育种改良进程的设想。形态学标记等常规遗传标记是最早用于植物育种辅助选择的标记，但由于�鞘�可佟⒁糯�榷ㄐ圆睿�页３Ｓ氩涣夹宰戳���蚨��檬艿胶艽笙拗啤＝��昀矗�肿由�镅Ъ际醯姆⒄刮�参镉�痔峁┝艘恢只��NA变异的新型遗传标记――DNA分子标记，或简称分子标记。与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代作物遗传育种研究的各个方面，大量以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得丰硕的成果。尤其是当分子标记技术走出实验室与常规育种紧密结合后，正在为植物育种技术带来一场新的变革。


一 遗传标记


遗传标记（Genetic marker）指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记包括形态标记（morphological marker）、细胞学标记(cytological marker)、生化标记(biochemical marker)和分子标记(molecular marker)四种类型。在植物遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：（1）多态性高；（2）表现共显形；（3）对农艺性状影响小；（4）经济方便，容易观察记载。
形态标记即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。
细胞学标记即植物细胞染色体的变异。包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。
生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。
分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表现为：（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。目前分子标记已广泛用于植物分子遗传图谱的构建；植物遗传多样性分析与种质鉴定；重要农艺性状基因定位与图位克隆；转基因植物鉴定；分子标记辅助育种选择等方面。


二 分子标记主要类型、原理与特点


分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）、简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）、序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）、序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）、表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。以下将介绍其中最常用的一些标记技术。
1 RFLP
该技术由Grodzicker等于1974年创立。特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。
RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。


2 RAPD
由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。
PCR技术是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年首创。该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数百万倍。其原理与细胞内发生的DNA复制过程相类似，首先是双链DNA分子在邻近沸点的温度下加热时便分离成两条单链DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链，以上过程为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，经过20-30个循环后，介于两个引物间的特异DNA片段以几何数得以大量复制。

RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。
RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
3 AFLP
由Zabeau和Vos于1993年发明。AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术的简便高效性，同时又能克服RFLP带型少、信息量小以及RAPD技术不稳定的缺点。其基本技术原理和操作步骤如下：首先用限制性内切酶酶解基因组DNA，形成许多大小不等的随机限制性片段；接着在这些片段的两端连接上特定的寡聚核苷酸接头（Oligo nuleotide adapter）；然后根据接头序列设计引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3’端加入1-3个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合，成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的；最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。
AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。
4 SSR（SSLP）
由Moore等于1991年创立。SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。
SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。
5 STS
由Olson于1989年开发成功。STS是指基因组中长度为200-500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，通过PCR可将其专一扩增出来。其基本原理是，依据单拷贝的RFLP探针、微卫星序列、Alu因子等两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增，电泳显示扩增产物多态性。有时扩增产物还需要特定的限制性内切酶酶解后才能表现出多态性。目前用于STS引物设计的主要是RFLP探针。
STS标记的主要特点有：（1）标记来源广，数量多；（2）共显性遗传，可区分纯合子和杂合子；（3）技术简便，检测方便；（4）与SSR标记一样，开发依赖于序列分析及引物合成，成本较高；（5）多态性常常低于相应的RFLP标记，这是因为STS仅仅检测该引物所分布区域的片段差异或酶切位置差异，而RFLP标记的多态性往往可能是探针以外区域的差异，这一部分差异无法转化成STS标记的多态性。
6 染色体原位杂交
染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。用作植物染色体原位杂交的探针因研究目的不同有许多种，主要的有：用于物种起源和亲缘关系研究的物种专化DNA序列或外源物种总基因组DNA；用来构建染色体物理图谱的低拷贝或单拷贝序列；用于转基因植物鉴定的含目的基因的BAC和YAC克隆。原位杂交技术的基本步骤为：制备探针；染色体制片；染色体处理与变性；染色体与探针杂交；显微检测。
染色体原位杂交技术比较简便，结果直观。但其灵敏度和分辩率很大程度上依赖于制片技术和观察设备，一般实验室无法满足需要。


三 分子标记技术的应用
1 分子遗传图谱的构建
目前几乎所有重要农作物，如拟南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麦、大豆、马铃薯、棉花、油菜等的RFLP图谱均已构成，随着多种标记的不断添加与定位，分子遗传图谱正日渐趋于饱和。水稻第一张分子图谱是美国cornell大学于1988年发表的，当时仅有RFLP标记136个，覆盖水稻基因组的1389cM，标记分布也不甚均匀，有明显的空白区域（Gap）；而由日本水稻基因组计划1998年发表的水稻分子图谱已包括了2275个标记，其中70%为EST，覆盖了1550cM，平均图距为1.5 cM。遗传图谱对于基因定位至关重要，图谱上包括的标记数越多，分布越均匀，则基因定位就越精细。高密度分子遗传图谱的绘制使一些植物的遗传学研究取得了重大进展，并对分子标记辅助育种选择技术和基因图位克隆技术的发展产生了巨大的推动作用。
2 遗传多样性与种质鉴定
分子标记广泛存在于基因组DNA的各个区域，数量巨大，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对种质进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。而以分子标记为基础的比较基因组研究则有利于探明近缘物种间的遗传同源性以及物种起源等生命科学领域中的重要问题。
微卫星标记等具有很高的多态性，可以用于鉴别同一物种的不同基因型，如Olufowote等选择4个SSR标记即可有效地评估栽培稻内不同品种间的异质性；Guifford等用3个SSR标记就能区分21个苹果品种。分子标记的这一特点还可用于鉴别品种的混杂情况和真假杂种的判断等。
3 重要农艺性状相关基因的定位
基因定位就是确定基因在染色体上的位置及与之相连锁的分子标记，高密度分子遗传图谱的构建使基因定位工作变得相对容易。
目前已完成了重要作物大量控制农艺性状表现如抗病性、抗虫性、育性等的主基因的定位工作，为开展这些基因的分子育种奠定了基础。尤为重要的是分子标记技术为呈数量遗传、易受环境条件影响的重要农艺性状的QTL定位提供了有效手段，目前涉及到QTL图谱绘制及大量复杂的数据统计、分析、运算工作已有多个配套的计算机软件被开发出来。QTL的定位使得控制数量性状的多基因被转变成一个个独立的“主基因”，便于进行遗传操作，这无疑有利于对产量、生育期等性状的定向改良。
4 分子标记辅助选择
选择是育种的重要环节，传统育种对目标性状多采用直接选择的方法，但作物的许多农艺性状不容易观测或易受环境影响、表现不稳定，直接选择比较困难。而在完成基因的分子标记定位后，就可以通过连锁标记对这些性状进行间接选择，从而提高它们的选择效率。
与传统选择相比，分子标记辅助选择有许多显著的优点，主要体现在：（1）可以清除同一座位不同等位基因间或不同座位间互作的干扰，消除环境的影响；（2）在幼苗阶段就可以对在成熟期表达的性状进行鉴定，如果实性状、雄性不育等；（3）可有效地对表型鉴定十分困难的性状进行鉴定，如抗病性、根部性状等；（4）共显性标记可区分纯合体和杂合体，不需下代再鉴定；（5）可同时对多个性状进行选择，开展聚合育种，快速完成对多个目标性状的同时改良；（6）加速回交育种进程，克服不良性状连锁，有利于导入远缘优良基因。
将分子标记辅助选择应用于作物改良的实践中，已取得一些实质性进展。如国际水稻所利用与Xa-4，xa-5，xa-13和Xa-21四个抗白叶枯病基因连锁的STS标记辅助选择，成功地将这四个基因以不同组合方式聚合在一起，育成了高抗、多抗白叶枯病水稻新品种。不过目前多数相关研究还停留在辅助选择的技术策略方面，成功的事例很少。究其原因有：（1）直接交给育种家使用的PCR为基础的标记还不多，已筛选出的标记在不同遗传背景下不稳定；（2）还缺乏真正意义上的低成本、高效率、操作简便的标记检测体系；（3）部分研究人员的知识结构不合理，植物育种家与分子遗传学家之间的有机结合、相互沟通不够。
5 重要农艺性状的图位克隆
图位克隆（Map-based cloning）是近几年随着植物分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术。利用分子标记辅助的图位克隆无须事先知道基因的DNA序列，也不用了解基因的表达产物是什么就可以直接克隆基因。图位克隆技术首先在拟南芥中取得成功，后来在番茄、大麦、小麦、甜菜、水稻中也利用了这一方法。如在水稻中运用这一技术已分离出抗白叶枯病基因Xa-21、Xa-1，抗稻瘟病基因Pi-b和矮生突变基因D1。
图位克隆是最为通用的基因识别途径，至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列，已为图位克隆的广泛应用铺平了道路。