分子标记技术

 

标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。与育种有关的遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker ）、细胞标记（cytological markers ）、生化标记（Biochemical marker ）和分子标记（molecular marker ）。早在1923 年，Sax 等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA 组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA 变异的新技术手段，即分子标记技术。与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA 形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息
一 、常用的分子标记技术
　　利用分子标记技术分析生物个体之间DNA 序列差别并用于作图的研究始于1980 年。经过十几年的发展，现在的DNA 标记技术已有十多种，主要有两大类。
一、基于Southern 杂交的分子标记
　　这类标记利用限制性内切酶酶切不同生物体的DNA 分子，然后用特异探针进行Southern 杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA 的多态性。主要有（一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ）
　　限制性片段长度多态性， 简称RFLP ，是出现最早，应用最广泛的DNA 标记技术之一。RFLP 标记非常稳定，它是一种共显性标记，在分离群体中可区分纯合体与杂合体，提供标记位点完整的遗传信息。多种农作物的RFLP 分子遗传图谱已经建成。但其分析所需DNA 量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，尽管可用非放射性同位素标记方法代替，但成本高、成功率低，且实验检测步骤较多，依然影响其使用、推广。

       图7-1 RFLP 检测变异的原理                   图7-2 RFLP 图谱

（二）小卫星DNA （Minisatellite DNA ）
　　小卫星DNA （Minisatellite DNA ）又称数目可变串联重复序列（Variable Number of Tandem Repeat ，VNTR ）是一种重复DNA 小序列，为10- 几百核苷酸，拷贝数10-10000 不等。多态性由于重复单位之间的不平衡交换，从而产生不同等位基因，可通过杂交检测出。其缺点是多态性分布集中，合成探针困难，应用并不广泛。

图7-3 小卫星DNA 检测变异原理

二、基于PCR 技术的分子标记

（一）随机扩增片段长度多态性DNA 　（Random Amplified Polymorphic DNA ）
　　随机扩增片段长度多态性DNA ，简称RAPD 技术，是由Williams 和Welsh （1990 ）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。RAPD 以PCR 为基础而又不同于经典的PCR ，一般采用10 个核苷酸的DNA 序列为引物，扩增时退火温度降至35 ℃左右。与其它标记相比,RAPD 具有以下优点：　　　　　　　　　　　1 ）不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物基因组的分析。　　2 ）操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖基因组的分析　　

3 ）不需制备探针、杂交等程序，成本较低。　　　　　　　　　　　　　　　　

4 ）DNA 用量少（10ngDNA 即可完成一次分析），允许快速、简单地分离基因组DNA 。已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用（惠东威，1992 ）。RAPD 是一种显性标记，分离群体中纯合体和杂合体通过后代才能区别，并且由于该技术采用的是随机引物扩增，扩增结果的稳定性较差，这在一定程度上限制了其发展。

                               图7-4 RAPD 图谱                     
（二）特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism ，SAP ）
　　RFLP 技术成本高，实验步骤多，周期长；RAPD 标记稳定性较差，不利于育种中应用。在用RFLP 和RAPD 分析找到多态性DNA 片段以后，将它们转化为特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism ，SAP ）或称序标位（Sequence Tagged Sites ，STS ）可以解决这些缺点。主要包括以下两种：　　　　　　　　　　

1 ）酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence ，CAP ）将RFLP 探针的两端测序，合成22-mer 引物进行PCR 扩增，扩增产物往往无多态性，需用内切酶酶解产物，产生多态性。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

2 ）序列特异性扩增区（Sequence-characterized Amplified Region ，SCAR ）和位点特异相关引物（Allele －Specific Associated Primers ，ASAP ），对RAPD 、AFLP 片段两端测序，根据DNA 序列，合成24-mer 双引物进行PCR 扩增。SCAR 、CAP 可以降低了成本，操作简便，稳定性强，对仪器要求低，可实现自动化分析，适合于大样本的快速分析。

（三）简单重复序列（Simple Sequence Repeat ，SSR ）
　　简单重复序列（Simple Sequence Repeat ，SSR ）或称微卫星DNA （Microsatellite Repeat ）、简单串联重复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism ，STRP ）。在真核生物中，存在许多2-5bp 简单重复序列，称为“微卫星DNA ”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR 扩增，揭示其多态性。
（四）扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism ，AFLP ）
　　扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism ，AFLP ），又称选择性限制片段扩增（Selective Restriction Fragment Amplification ）。先将DNA 用内切酶酶解，然后接上接头，根据接头的序列和酶切位点设计引物，即接头+ 酶切位点+2-3 个核苷酸，然后进行特异性PCR 扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可产生数量丰富的带型标记，分辨率高，是一种十分理想和高效的遗传标记。

 

图7-5 AFLP 的银染检测结果