RNA印迹杂交

RNA 印迹杂交

 

1）       Northern 印迹的制备

 

预备：

1． 按下述步骤，每泳道加 10 ～ 20 μ g 总 RNA 或 0.5 ～ 1 μ g poly(A)⁺ RNA 进行甲醛 / 琼脂糖凝胶电泳，将凝胶放在紫外线透照仪上，旁边置一标尺进行拍照。

a. 总 RNA （ 10 ～ 20 μ g ）用下列溶液在 65 ℃温育 5min ：

总 RNA （ 10 ～ 20 μ g ）	6.0 μ l
甲酰胺	12.5 μ l
10 × MOPS 缓冲液	2.5 μ l
甲醛溶液（ 37 ％）	4.0 μ l

b. 置冰浴迅速冷却，加 2.5 μ l 上样缓冲液，并加样于按如下配制的甲醛 / 琼脂糖凝胶中。

琼脂糖	1.0g
10 × MOPS 缓冲液	10.0ml
H2 O	73.0ml

c. 加热至 100 ℃溶解凝胶，然后置 50 ℃水浴箱降温。加 17ml 甲醛，混匀并立即倒胶。须在通风橱内带手套操作，用一电泳槽专供 RNA 电泳。

 

 

Northern 印迹

1． 当凝胶仍在电泳时，裁一张与凝胶大小相同的滤纸，以 20 × SSC 浸泡。

2． 安装转移装置，盘内倒入杂交缓冲液（ 20 × SSC ）。在缓冲液平面上做一平台，将凝胶盘倒置，并盖三张经 20 × SSC 饱和的滤纸（ Whatman 3MM ），平台两端的滤纸应浸入缓冲液中，用 10ml 的玻璃吸管滚动以赶除气泡并将滤纸推平。

3． 在滤纸表面倒入数 ml 20 × SSC ，将凝胶倒扣于滤纸上，小心赶除凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布粘贴或用塑料薄膜包裹以防缓冲液直接从凝胶周围流至纸中（虹吸短路）。

4． 用数 ml 20 × SSC 浸没凝胶，置滤膜于凝胶上，确保凝胶与滤膜之间无气泡。用软铅笔标记面对凝胶的滤膜面。

5． 滤膜表面放三张大小与滤膜相似并预先用 20 × SSC 浸泡的 3MM 滤纸。

6． 放一叠干燥吸水纸（印迹纸或纸巾）在 3MM 滤纸表面（约 5 ～ 8cm 高）。

7． 在折叠纸上放一玻璃板，并在玻璃板上置 0.75 ～ 1kg 重的物体。

8． 转移进行 12 ～ 16 小时，确保槽内有足够的 20 × SSC （约 3L ）。

9． 转印后，小心拆卸印迹装置，将凝胶与滤膜一起转移到干燥滤纸上，凝胶在上。用软铅笔标记凝胶和滤膜加样孔的位置，撕去凝胶。

10．  以 20 × SSC 漂洗滤膜片刻以去除琼脂糖残迹。

11．  将滤膜放在一块干燥的 3MM 滤纸上稍微晾干。

12．  固定 RNA 于滤膜上，将尼龙膜 RNA 面朝下在紫外透照仪照射 3 ～ 5min 。

13．  此滤膜可用于杂交或 4 ℃保存，尼龙膜需要塑料袋密封。

 

 

2 ） RNA 印迹杂交

1． 用 5 × SSPE 浸湿 RNA 滤膜。

2． 将浸湿的 RNA 滤膜转移至塑料袋中，塑料袋四周封口并剪去一角。

3． 预热预杂交液至 42 ℃，经塑料袋开口处加入 0.1ml/cm² 的预热的预杂交液，小心移取，避免加入气泡，从塑料袋中挤压出所有气泡，密封塑料袋。

4． 在 42 ℃水浴摇床中温育塑料袋 2 ～ 4 小时，或将塑料袋夹于两块玻璃板中置 42 ℃烤箱 2 ～ 4h ，确保滤膜表面无气泡。

5． 置 95 ℃ 10min 使探针变性，立即置冰浴冷却 5min 。

6． 剪去杂交袋一角，将预杂交液倒入 15 或 50ml 的 Falcon 试管中，加入约 10 ～ 20ng/ml （随机引物标记）探针，一般来说， 10⁶ ～ 10⁷ cpm/ml 已足够，轻轻混匀。用一次性塑料移液管将杂交液加入装有滤膜的塑料袋中。

7． 从塑料袋的开口处将气泡全部压出，用纸巾揩去流出的少许杂交液，小心封好袋口，避免液体漏出。必要的话，可将塑料袋套入另一个塑料袋内以防放射性污染。

8． 在 42 ℃水浴摇床中温育 12 ～ 16h ，或夹在两块玻璃板中置 42 ℃烤箱温育 12 ～ 16h 。

9． 杂交完毕，打开塑料袋的一角，将杂交液倒入 15 或 50ml 的 Falcon 试管中。小心不要使放射性溶液溅出。

10．  将塑料袋完全打开，用钝头镊子将滤膜转移至盘中以便清洗，立即用缓冲液（ 2 × SSC ， 0.1 ％ SDS ） 1 漂洗滤膜。

11．  室温下，用漂洗缓冲液 1 漂洗三次，每次 5min 。

12．  室温下，用漂洗缓冲液 2 （ 0.25 × SSC ， 0.1 ％ SDS ）漂洗两次，每次 5min 。

13．  用预热 45 ℃的漂洗缓冲液 2 漂洗 1 ～ 3 次，每次 15min 。在更换缓冲液之间，应用盖革计数器检测滞留在印迹中心的放射性。

14．  充分漂洗后，把杂交膜放在一张 3MM 滤纸上稍晾干后，将潮湿的滤膜封在塑料袋内或用塑料薄膜包裹。

15．  滤膜放射自显影：将杂交膜（包裹在塑料袋内， RNA 面朝上）放在 X 射线暗盒底部，胶片放在其上。为方便起见，可将增感屏固定在暗盒盖上，关闭暗盒，在－ 70 ℃曝光 1 天～ 2 周。

16．  将暗盒从冰箱内移出时，应有足够的时间（ 30min ～ 1h ）使其温度调至平衡。在暗室将胶片从暗盒取出，并在自动 X 线底片处理仪上冲洗。

 

 

3） 从杂交膜上除去探针

1． 煮沸 0.1 ％ SDS 溶液。

2． 把膜放在玻璃盘内，将溶液倒在膜上，凉至室温。

3． 用盖革计数器检测降低的活性。