RNA点杂交

RNA 点杂交

 

1）  纯化的 RNA 的点杂交和狭线杂交

 

安装印迹装置

 

1． 切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿，在 20 × SSC 中室温泡 1 h 。

2． 在膜浸泡期间，先用 0.1 mol/L NaOH 小心清洗印迹装置，再用无菌水洗干净。

3． 把两片厚滤纸用 20 × SSC 浸湿，再放到真空器顶部。

4． 把样品槽插入装置的上部，把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部，用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。

5． 加紧夹板，连接真空管。

6． 加入 10 × SSC 直至液面没过尼龙膜，关掉真空，再用 10 × SSC 充满。

 

 

RNA 样品准备

 

1． 把每个 RNA 样品（溶解在 10 μ l 水）分别与 30 μ l RNA 变性液混合。

2． 65 ℃温育 5 min ，然后在冰上冷却。

3． 向每个样品中加入等体积 20 × SSC 。

4． 轻轻向印迹装置中吸入 10 × SSC ，直到淹没尼龙膜。

 

 

RNA 样品的印迹和 RNA 在膜上的固定

 

1． 把所有样品轻轻加入狭线中，然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后，每个狭线用 1 ml 10 × SSC 洗两次。

2． 当第二次洗膜完成后，继续轻轻吸干膜。

3． 取下膜，用紫外交联、烘烤或微波照射把 RNA 固定在膜上。

 

 

固定化 RNA 的杂交与洗膜

 

1． 把膜放入烤盘或杂交炉中，加入 10~20 ml 预杂交液 68 ℃温育 2 h 。

2． 把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育 12 ～ 16 h 。

3． 杂交完后从塑料袋中取出膜，然后尽可能快地把膜转移到室温下装有 100 ～ 200 ml 、 1 × SSC （ 0.1% SDS ）的塑料容器中。盖紧塑料容器，放到摇床上轻摇 10 min 。

4． 把膜转移到另一个装有 100 ～ 200 ml 、预热到 68 ℃的 0.5 × SSC （含 0.1% SDS ）的塑料袋中，然后在此温度下轻摇 10 min 。

5． 按步骤 17 重复洗膜两次，使总的洗膜次数达到三次。

6． 用滤纸吸干膜，在 -70 ℃条件下放射自显影 24 ～ 48 h （ Kodak XAR-5 或相当的胶片）。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然，磷光成像仪也可以用来成像。

 

 

2 ） RNA 斑点印迹的制备（详见《分子医学技术》 106 页）

 

1． 裁一张大小合适的滤膜，用软铅笔标记 RNA 加样的位置，一个 cm 的方格即可。

2． 以 20 × SSC 浸泡滤膜。

3． 在 65 ℃用以下溶液温育 5min ，使 10 ～ 20 μ g 的总 RNA 变性。

总 RNA （ 10 ～ 20 μ g ）	2.0 μ l
变性液	6.0 μ l

    置冰浴快速冷却 5min ，用微量离心管离心片刻以回收液滴，将管置于冰浴。

4． 将滤膜铺在一叠经 20 × SSC 浸泡过的滤纸（如 Whatman 3MM ）上。

5． 在膜上点样，每孔 4 μ l RNA ，待一孔干燥后再加另一孔。

6． 将滤膜置滤纸（ 3MM ）上稍微晾干，用 20 × SSC 漂洗片刻。

7． 当滤膜仍潮湿时，将滤膜 RNA 面朝下在紫外线透照仪照射 3 ～ 5min ，使 RNA 固定于滤膜上，此滤膜已可用于杂交。