RNA的斑点杂交--杂交

[试剂与仪器]

(1)预杂交液：5×SSC，2×Denhardt液(或采用试剂盒的相应试剂)，0.02%(W/V)SDS

(2)杂交液DIGEasyHyb

(3)杂交袋

(4)含0.1%SDS2×SSC和含0.1%SDS0.1×SSC

[操作步骤]

(1)预杂交

①先将预杂交液热至60℃；

②将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的杂交袋，加入预杂交液，按每100cm2滤膜加20ml；

③尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，将其置60℃水浴过夜，其间不断翻动塑料袋

(2)杂交

①杂交液DIGEasyHyb(20ml/100cm2)预温轻振荡30min；将标记探针DNA(5～25ng/ml)煮沸变性5min，迅速置冰水中冷却

②加入到预温的D1GEasyHyb(2.5ml/100cm2)中混合，避免形成气泡；

③探针/D1GEasyHyb注入杂交袋中，封好杂交袋；

④68℃振荡孵育至少6h，在微量DNA时建议16h，使其杂交；

⑤2×SSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min室温；

⑥68℃振荡条件下，0.1×SSC，0.1%SDS清洗2次，每次15min。

[注意事项]

(1)中和：尤其是计划使用硝纤膜时，凝胶中和后需查一下pH值，pH值应小于9.0，否则会导致膜变黄和破坏。尼龙膜可以承受更高的pH值。

(2)转移：最好选用尼龙膜(带正电荷)。处理膜时绝对小心，不能将指痕印在膜上，只能用无齿镊夹边角位置。

(3)固定：转膜后的DNA必须固定才能用于杂交。方法有二，其一是紫外光照射；其二是120℃烘烤30分钟(尼龙膜)或180℃真空烘烤2小时(硝纤膜)。相比之下，照射更为简便。

(4)标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含SDS，Tween20的溶液应经滤膜除菌后加入其它溶液；使用灭菌吸头，干净器皿，每次用前必须严格清洗。操作膜时戴无尘手套；只用无齿镊操作膜的边缘。

(5)探针浓度探针浓度是非常重要的因素，应予高度重视。浓度过高会增加背景，浓度过低又会导致敏感性下降。应通过模拟杂交试验来确定最佳浓度。

(6)可用β-actin作为内参考对照。