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RNA的斑点杂交--样本RNA点膜

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一、试剂与仪器

1. 20×SSC(标准柠檬酸盐缓冲液)(pH 7.0)

NaCl 175.3g

柠檬酸钠 88.2g

加H2 O至 1000ml

用10N NaOH or 10N HCl调pH至7.0,高压灭菌。

2. 37%甲醛

3. 甲酰胺

4. 2×Denhardt液

5. 硝酸纤维素膜

6. 多孔过滤加样器和真空泵

7. 恒温水浴摇床

8. 加样器和吸头等

二、操作步骤

1. 样本RNA变性:

20 μl RNA溶液(2μgRNA)

4 μl 20×SSC

14 μl 37%甲醛

40 μl 100%甲酰胺

将上述溶液均匀,置60℃温育30 min,冰浴冷却样品,使样本RNA变性。在上述RNA液体中每100 ul液中加210 ul 20×SSC(共310 ul),作为点样溶液,点样时每孔加150 ul。

2. 纤维素膜处理:硝酸纤维素膜(0.45 um)水中浸泡5 min,再用20×SSC室温浸泡1h。

3. 滤器的处理及点样:用0.1 M NaOH浸泡(洗)多孔过滤加样器,再用灭菌水彻底冲洗。将纤维素膜压在多孔加样器的上层板的上面,再压在下层板上,赶去气泡,然后两部分夹紧,点样前,先用20×SSC(200 μl)洗一遍每个孔,真空抽吸干净后,再分别点样。

如有未点样孔须用150 ul 的20×SSC封住其孔,然后用真空泵抽吸干净,再用20×SSC清洗一次,待流体滤过纤维膜后,继续抽吸5 min 以干燥滤膜。

4. 取出膜,80℃烤2~3 h,膜保存于-20℃。

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