合作专家 | 曾倩晖博士
动物遗传育种繁殖 华中农业大学
审核专家 | 聂壹峰博士
纳米生物医学 中国科学院大学
简介
斑点杂交(dotblot)是一种检测、分析和鉴定 DNA、RNA 和蛋白质的技术,通过显影斑点的有无及颜色的深浅来判断是否有杂交及其杂交强度。作为目前高等真核生物和植物中最丰富的一种 RNA 转录后修饰,m6A 修饰能够调控 RNA 的剪接与转运、稳定性、出核和翻译成蛋白质的效率。因此在研究 RNA 的 m6A 修饰时经常用到斑点杂交来对细胞内总 RNA 的 m6A 修饰水平进行定性或半定量分析。
原理
m6A 斑点杂交是指将待测的 RNA 变性后点加在硝酸纤维素膜或 NC 膜上,紫外交联固定后用 m6A 抗体进行杂交,洗膜,放射自显影,以斑点有无或颜色的深浅代表 m6A 修饰水平的高低。
用途
检测细胞内总 RNA 的 m6A 修饰水平变化。
材料与仪器
m6A 抗体(能做斑点杂交的抗体)、20 × SSC 缓冲液、混合床树脂 PCR 仪、硝酸纤维素膜、中波 302 nm 波长的紫外灯、PBST、二抗 IgG、亚甲基蓝粉末、醋酸钠(M=136)、ECL 显影液和化学发光成像仪
试剂配制:
(1)PBST 缓冲液配制:商业化的 PBS 粉末加 2 L 蒸馏水溶解,随后加入 1 mL 的 Tween-20,混匀即可使用,室温保存。
(2)37% 去离子甲醛配制:0.3 g 混合床树脂加入 3 mL 国药甲醛,来回混合,使树脂部分由蓝色变成金黄色,短暂离心后小心吸取上清分装,室温保存。
(3)亚甲基蓝溶液配制:称取 20 mg 亚甲基蓝粉末溶解于 10 mL 0.3 mol/L 的醋酸钠溶液中,充分溶解后形成深蓝色溶液,室温保存。
(4)0.3 mol/L 醋酸钠溶液配制:称取 20.4 g 醋酸钠溶解于 500 mL 去离子水中,加入盐酸,调节 pH=5.2 左右。
步骤
1、用 Trizol 试剂从细胞中分离出总 RNA,尽量将不同处理组的 RNA 浓度调整一致。
2、配置变性液(RNA 变性液由 20 × SSC 缓冲液:37% 去离子甲醛=3:2 配成);将变性液与 RNA=1:1 混匀,PCR 仪中 95 ℃ 反应 5 min,使核酸变性。
3、变性后的样品快速点样在硝酸纤维膜上,随后在 302 nm 紫外灯下照射交联 6 min。
4、交联后,用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 min;然后用 5% 的脱脂奶粉室温封闭 2 h,用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 min,再用 m6A 抗体在 4 ℃ 下孵育过夜。
5、随后在 PBST 缓冲液中洗涤 4 次,每次 5 min,用对应的二抗 IgG 在室温下孵育 2 h,再用 PBST 缓冲液洗涤 4 次,每次 5 min。
6、利用 ECL 显色液进行 ECL 显影。
7、亚甲基蓝定量核酸:取一张同样处理的膜,滴加等同体积的样品,经过紫外交联之后,进行亚甲基蓝染色,将膜放置于溶液中染色 10 min,PBST 洗涤 10 min,期间更换多次 PBST 后,拍照。
注意事项
1、亚甲基蓝很难清洗,实验操作中要记得戴口罩和穿白大褂。在进行亚甲基蓝染色时,注意尽量不要吸取底部沉淀。
2、核酸变性液要现配现用。
3、变性后的 RNA 可放在 4 ℃ 冰箱,一个星期内做完实验即可。
4、在硝酸纤维素膜上点样时,要用水性笔在膜上做好标记,以免记错顺序。
5、点样时,速度要快,要用无 RNA 酶的枪头进行点样,每个样品需要更换枪头。
6、点样时,样品体积最好不要超过 1 μL,以免造成扩散,不能很好的形成斑点。
7、化学发光成像仪的选择也有略微的区别,最好选择可以自己调整曝光时间的化学发光成像仪。
常见问题
1、显影的时候容易过曝?
答:降低上样量,在做正式试验前最好先自己找一下最好的浓度范围。一般可以从 500 ng~100 ng 的一个范围都可以。
2、亚甲基蓝染色后,斑点不明显?
答:一般来说,亚甲基蓝染色 10 min 即可。但是也需要根据自己具体的上样量调整染色时间。可以在染色过程中用镊子(镊子最好是平头的,不易损伤硝酸纤维素膜)夹出来观察,当看到清晰可见的蓝色圆点就可以停止染色。同样脱色的时间也需要自己时刻观察,一般当观察到背景色和斑点的颜色可以明显区分的时候即可。
来源:丁香实验