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DNA片段回收与纯化

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    质粒、噬菌体等经酶切,电泳;PCR产物经电泳后,常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化,用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等,也有现成的试剂盒供应。
一、 冻融法
1.   紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条,将切下的胶条(小于0.6g)捣碎,置于1.5ml离心管中;
2.   加入等体积的Tris-HCl饱和酚(pH 7.6),振荡混匀;
3.
  -20℃放置5-10min;
4.   4℃离心10000g×5min,上层液转移置另一离心管中;
5.   加入1/4体积H2 O于含胶的离心管中,振荡混匀;
6.
  -20℃,放置5-10min;
7.   4℃离心10000g×5min,合并上清液;
8.   用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次,取上清;
9.   加入1/10体积3M NaAc(pH 5.2)、
2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀;
10. -20℃,静置30min;
11. 4℃离心13000g×10min,弃上清,75%乙醇洗沉淀1-2次,晾干;
12.   加适量H2 O或TE溶解沉淀。

二、DNA回收试剂盒( QIAquick Gel Extraction Kit Protocol)
1.   紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶,置1.5ml离心管中,称重。
2.   加入Buffer QG(每100mg凝胶加Buffer QG 300μl),置5 0℃水浴10min。
3.   若回收片段小于500bp或大于4kb,则需加入异丙醇(每100mg凝胶加异丙醇100μl),混匀。
4.   将小柱放在2ml收集管上,将上述溶液加于柱上。
5.   4℃离心13000g×1min,弃去收集管中液体。
6.  
加入500μl Buffer QG于柱上,4℃离心13000g×1min,弃去收集管中液体。
7.   加入750μl Buffer PE于柱上,4℃离心13000g×1min,弃去收集管中液体。
8.   4℃离心13000g×1min。弃去收集管。
9.  
将柱放于一新1.5ml离心管上,加50μl EB于柱上。放置1min,4℃离心13000g×1min。
10. 取5μl 回收DNA电泳检测。
三、 注意事项
    紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时,要衬以干净的塑料薄膜,使用无DNA污染的新刀片,其目的在于防止外源DNA的污染。

 

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