DNA片段回收与纯化
丁香园
5008
质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。
一、冻融法
1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；
2. 加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀；
3. -20℃放置5-10min；
4. 4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；
5. 加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；
6. -20℃，放置5-10min；
7. 4℃离心10000g×5min，合并上清液；
8. 用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；
9. 加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；
10. -20℃，静置30min；
11. 4℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；
12. 加适量H2O或TE溶解沉淀。
二、DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）
1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。
2. 加入Buffer QG（每100mg凝胶加Buffer QG 300μl），置50℃水浴10min。
3. 若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。
4. 将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。
5. 4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。
6. 加入500μl Buffer QG于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。
7. 加入750μl Buffer PE于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。
8. 4℃离心13000g×1min。弃去收集管。
9. 将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μl EB于柱上。放置1min，4℃离心13000g×1min。
10. 取5μl 回收DNA电泳检测。
三、 注意事项
紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
