毛状根培养技术

相关专题

 

毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T—DNA片断整合进植物细胞核 基因组中诱导产生的一种特殊表现型，近10年来已发展成一种新的培养系统。
发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根性,是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。在Ri质粒上，存在与转化有关的两个主要功能区，即T-DNA (转移区)和Vir　(致病区)。Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组 中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。处理菌株后可提高Vir区的表达并明显提高药用植物外植体的转化率。　
发根农杆菌Ri质粒有几种不同的类型，分别是农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。其中含有农杆碱型Ri质粒的菌株通常具有更广泛的宿主范围和更强的致根特性。经发根农杆菌侵染植物 形成的毛状根适离体培养能够再生植株，而且许多植物的毛状根在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，产物产量较正常植物及悬浮培养细胞的要高。因此Ri质粒可应用于有价值的次生代谢产物的生产。
与植物细胞培养相比，毛状根培养具有生长速度快、激素自养、分化程度较高以及遗传性状相对稳定等优点。由于近三分之一传统药材的药用部位是根，所以这一培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义。

1. 毛状根诱导常用菌种
常用于实验的发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes ）有：ATCC15834、ATCC39207、G58P GV3296、A4、NCPPB2659、Rl500、Rl601、LBA9402、TRl05等菌株，这些菌株中含有侵入性致根质粒（root inducing plasmid）Ri质粒。

2. 毛状根的诱导操作（以黄芪为例简述毛状根的诱导方法）
①黄芪无菌苗培养：黄芪种子表面消毒后接种于MS培养25 ℃下暗培养，待苗长至4cm左右时取其不带芽的下胚轴作为共培养的材料。
②发根农杆菌的培养与保存：农杆菌可在平板培养基上于4℃下保存数月，而在-70 ℃的低温冰箱中可长期保存。农杆菌快速生长过程中．常常会出现质粒丢失，基因突变。要使转化最为有效就要利用对数生长期的农杆菌来转化。发根农杆菌15834的质粒上带有抗cefotaximes选择标记基因，将农杆菌培养于 YEB培养基上， 25 C下培养，每周转接一次，感染前两天转接一次。
③针刺接种感染与共培养：把黄芪下胚轴切段后，用解剖针蘸取培养好的发根农杆菌，在黄芪下胚轴上扎眼，之后黄芪切段接种于含500mg/L cefotaxime的MS培养基上培养。25℃黑暗下诱导毛状根。长出的毛状根经多次转接去除农杆菌之后转入MS中培养可速生长，转化的毛状根生长大大快于未转化的根培养物。

3. 毛状根的鉴定
诱导出的毛状根是否确为转基因产物还需鉴定。毛状根可以从形态水平上给于鉴定，它不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。这些表型的特征与未转化的根不同，可区分开。可以通过毛状根中GUS活性的测定或NPTII酶的检测从组织水平来证明Ri质粒中的T－DNA是否转移整合到植物细胞的核因组上。
冠瘿碱的测定可作为细胞水平的毛状根鉴定方法，因为冠瘿碱合成酶基因在发根农杆菌中并不能表达，它只能在植物细胞中表达。冠瘿碱的存在可作为植物细胞转化的指标。冠瘿碱的测定可用高压纸电泳方法，用碱性硝酸银溶液染色，硫代硫酸钠溶液固定。